раціональний дизайн ліків ярмолюк сергій

Мішень-спрямований пошук нових ліків

Про сучасний стан розробки нових ліків в Україні й світі та раціональний дизайн ліків – інноваційну технологію розробки нових ліків.

Доповідь д.х.н., проф., завідувача відділу біомедичної хімії ІМБіГ НАН України Сергія Ярмолюка на ХXІV Українській конференції з органічної хімії  

Вважаємо, що з термінологією медичної хімії є певні проблеми. Ґрунтовного українського підручника з продуманими термінами не існує. Переважна більшість підручників з медичної хімії, укладених російською, використовують звичайну кальку термінів з англійської мови.

Наприклад, термін «lead compound» у нефахівця асоціюється зі сполукою, що як лідер проходить незмінно й успішно через увесь етап lead-оптимізації. Хоча в 98 % цей лідер веде до поразки, і на фініші це зовсім інша сполука, що має іншу хімічну структуру.

З огляду на це в доповіді будуть уживатися англомовні терміни з, можливо не завжди, вдалим українським перекладом.

Принагідно зазначимо, що концептуально найкращим підручником з медичної хімії в СНГ є підручник «Медична хімія» В. Орлова та В. Ліпсон.

Сучасні технології розробки першокласних ліків вимагають величезних фінансових витрат – близько мільярда євро. Тому маркетологічні дослідження повинні лежати в основі будь-яких наукових досліджень із розробки ліків.

Перший етап розробки ліків – виявлення так званих незадоволених потреб.

Фармацевтичні компанії розробляють лише ті ліки, які можуть дати їм потенційний прибуток.

Проведемо невелике маркетологічне дослідження перспектив світового фармацевтичного ринку і можливих джерел фінансування наукових досліджень в Україні.

Західні фармацевтичні компанії для планування своєї діяльності використовують так звані консенсус-прогнози аналітичних маркетологічних фірм. Консенсус-прогноз – це узагальнювальний прогноз багатьох спеціалістів-експертів.

Ось лише деякі важливі тенденції фармацевтичного ринку на прикладі прогнозу EvaluatePharma:

Збільшення тривалості життя. Це означає, що країни т.зв. золотого мільярду (США, Канада, Австралія, країни ЄС), очевидно, будуть фінансувати розробку ліків для лікування хвороб літніх людей. Йдеться зокрема, про нейродегенеративні захворювання, такі як хвороба Паркінсона та Альцгеймера. Готуючи пропозиції до УНТЦ, бажано враховувати цю тенденцію.

Ліки для лікування онкологічних, серцево-судинних та інфекційних захворювань завжди в тренді.

Персофікована медицина. Лікування пацієнта на основі його генетичного паспорта. Вважається, що саме генетичні особливості кожної людини зумовлюють те, що на багатьох людей ліки не діють. У людини може бути ген, який зумовлює швидкий метаболізм ліків. Концентрація падає, і ліки не працюють. Над першим геном людини працювали 13 років. Нині в США можуть зробити геном за 5 тисяч доларів, а в Китаї це вартуватиме набагато дешевше – близько 500 доларів.

Досить негативна тенденція – зменшення фінансування розробки нових органічних малих молекул. Оскільки мільярд, що витрачається на розробку нових ліків, розподіляється між багатьма іншими фірмами, що співпрацюють з фармацевтичними гігантами, то це погані перспективи для спонсорів цієї конференції, які працюють переважно у форматі аутсорсингу.

Найбільш негативна тенденція для медичних хіміків – це поступове витіснення малих органічних молекул як лікарських засобів біотехнологічним препаратами.

В 2015 році біологічні ліки становили 24 % від загальних продажів, у 2022 році прогнозують 29 %.

Нині на ринку багато різних біологічних препаратів, які, на відміну від традиційних хімічних ліків, мають складний хімічний склад. Якщо патентний захист закінчився, то ймовірність отримати повністю ідентичний біологічний препарат дорівнює нулю.

Відповідно FDA увів таке поняття, як biosimilars – наближений аналог дженерика. Процедура реєстрації препарату biosimilar набагато дорожча, ніж звичайних дженериків. Як наслідок, фірма-виробник оригінального biologic має конкурентні переваги над тими, хто намагається скопіювати їхній препарат.

А в кінцевому підсумку зменшується фінансування хімії малих молекул і збільшується фінансування біологічних ліків. Про свідчить прогнозований обсяг продажів ТОП 100 ліків на 2022 рік.

Чи можна сподіватися на державне фінансування? Запитання риторичне. Вважаємо, що основна проблема полягає навіть не в браку коштів, а власне, в рудиментарному постсоціалістичному мисленні наших державних чиновників, які «розробляють» та фінансують програми з розробки ліків… Які розробки, коли всі фармацевтичні компанії приватні?

Держава повинна підтримувати належний рівень національної науки. Фінансувати дослідження, створювати бази даних, які могли б використовувати для розробки нових ліків приватні фірми й академічні установи, як, наприклад, це відбувається в США.

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, який я представляю, співпрацює з Національним інститутом алергії та інфекційних захворювань США. Співпраця полягає в пошуку нових сполук для лікування туберкульозу. Відповідно до угоди між цими інститутами ми маємо три місяці на патентування результатів. Потім дані публікуються для загального доступу. Досить простий договір про співпрацю. Права належать вам. Рекомендуємо співпрацювати з цією американською установою.

Подавати проекти з медичної хімії до європейської програми «Горизонт 2020», вважаємо, не варто. У програмі є досить загальний напрям «Health», в якому йдеться про те, що здоров’я – це багатство. Фінансування в основному йде на покращення системи охорони здоров’я в Європі.

Як показує досвід, фінансову вигоду від «Горизонт 2020» мають лише різні чиновники від науки, що організовують різноманітні тренінги за європейські гроші… Переважна більшість українських пересічних учених не вписується у формат цієї програми.

Українським науковцям потрібні невеликі підтримуючі гранти, щось на зразок INTAS. Просимо наших вельмишановних академіків звернути на це увагу.

Ще декілька слів про так звану програму «Горизонт 2020» для малих і середніх підприємств (Small and Middle Enterprises – SME). Фінансування – 50 тис. євро. Права належать науковцям. Звіти спрощені.

За трикутником Дмитрія Сосунова з литовської фірми «CIVITTA» оцінюється ймовірність отримання фінансування від ЄС. Інноваційність – відсутність аналогів на ринку, потенційний попит на ринку і, власне, професійність команди. До того ж науковці повинні мати ще й дослідний зразок…

Одним словом, отримати фінансування на розробку нових ліків чи органічний синтез практично неможливо.

Одне із можливих фінансових джерел – це виконання так званих контрактних наукових досліджень. Це об’єктивно. Аутсорсинг для західних фірм завжди буде дешевше.

Проте останнім часом різко зросла конкуренція. Окрім того, західні компанії почали працювати винятково через посередників. Основна мета таких посередників VALUE BEYONG SAVING – зменшити видатки й ризики аутсорсингу. Вони відбирають найдисциплінованіших постачальників із найнижчими цінами.

За нинішньої скрутної фінансової ситуації академічний аутсорсинг, на наш погляд, залишається єдиним реальним додатковим джерелом доходів.

Отже, будемо вважати, що ми знайшли фінансування. Перейдемо до дизайну ліків.

Що таке молекулярна мішень? Це переважно білок, який критично задіяний у перебігу певної хвороби на молекулярному рівні. Якщо ми блокуємо цей білок, то, відповідно, пригальмовуємо чи повністю зупиняємо перебіг тієї чи іншої хвороби.

Наприклад, фактори росту фібробластів зв’язуються з відповідними рецепторами, і запускається механізм ангіогенезу – росту кров’яних капілярів. У нормі в дорослому організмі процеси ангіогенезу відбуваються лише під час регенерації пошкоджених тканин. У злоякісних пухлинах ангіогенез відбувається постійно й дуже інтенсивно. Пухлинні клітини найкраще забезпечуються кров’ю, поживними речовинами, їм потрібні кров’яні капіляри. Якщо ми певним способом заблокуємо цей білок, вилучимо його із сигнального шляху, то загальмуємо перебіг онкологічного захворювання.

Раціональний дизайн ліків – це інноваційна, сучасна технологія розробки нових ліків. Принагідно зазначимо, що й інші більш традиційні методології розробки ліків теж ефективні.

Раціональний підхід базується на знанні про біологічну (молекулярну) мішень.

Дві основні умови. Перша – потрібно мати докази того, що, впливаючи на мішень, ми впливаємо на перебіг хвороби. І друга – мішень повинна зв’язуватися з молекулами-ліками.

Як функціонує мішень?

Фактор росту фібробластів зв’язується з рецептором. Відбувається димеризація рецептора з наступною активацією трансмебранної тирозинової кінази через самофосфорилювання. Наслідком такого фосфорилювання є запуск сигнальних каскадів, що ведуть до синтезу ДНК і проліферації (росту) клітин.

Як заблокувати мішень?

Як варіант, можна дібрати низькомолекулярний інгібітор, що зв’язується з АТФ-зв’язувальним сайтом кінази та блокує її автофосфорилювання.

Інший варіант – отримати моноклональне антитіло, що зв’яжеться з рецептором і теж заблокує процес передачі сигналу. Моноклональні антитіла – це препарати антитіл, високоспецифічні до однієї антигенної детермінанти.

Варіанти використання біологічних ліків. Зліва на слайді моноклональне антитіло, яке зв’язується з рецептором і блокує його димеризацію. Праворуч – химерний білок, який має рецептор. Але цей рецептор не закріплений на поверхні клітини. Він плаває в міжклітинному просторі і виловлює, зв’язує білкові фактори росту. Trap – пастка.

Моноклональні антитіла за походженням мишачі, і щоб імунна система людини не знищувала ці ліки, вони гуманізуються. Це так звані химерні білки, у них є білкові компоненти людського походження.

На слайді показані біологічні молекули, які використовуються як молекулярні мішені. Переважно це білки. 45 % усіх молекулярних мішеней – GPCR рецептори. Це молекулярні мішені для розробки протиракових ліків, ліків проти діабету.

В одній із статей, опублікованій у Віснику Академії наук, наведено визначення раціонального дизайну ліків як передбачення взаємодії рецептора та ліганду на молекулярному рівні. Це неправильне визначення. Йдеться про окремий випадок, більш нижчого порядку.

Повернемося до слайду з визначенням раціонального дизайну. Це важливо, оскільки всі комп’ютерні методи базуються на аксіомі, що таке молекулярна мішень.

Отже, вибравши з допомогою молекулярних біологів молекулярну мішень, ми можемо починати пошук ліків. Ми повинні знайти малі органічні молекули, які будуть зв’язуватися з нашою мішенню і блокувати перебіг хвороби.

Як варіант можна використати т.зв. високопродуктивний скринінг. Узяти всі речовини, які є у вас на полиці, та вивчити їхню інгібувальну активність на вашій молекулярній мішені. Так у принципі всі і працювали до 2000 року.

Комп’ютерні методи зробили революцію в розробці ліків. З’явилося таке поняття, як віртуальний скринінг. Він моделює взаємодію малих молекул з мішенню, відбирає ті, які найкраще зв’язуються. Сполуки, які найкраще зв’язуються з молекулярною мішенню, з найбільшою ймовірністю можуть бути інгібіторами цієї молекулярної мішені.

Важливість комп’ютерної революції полягає, на наш погляд, у тому, що медичний хімік може працювати у звичному для нього форматі «структура – функція». Можна побудувати віртуальну модель комплексу мішені з малою молекулою та оцінювати, як хімічна природа замісників впливає на міцність комплексу, а міцність комплексу впливає на лікувальні властивості.

Принагідно зазначимо, що останнім часом не вистачає молекулярних мішеней і високопродуктивний скринінг починає застосовуватись у своєму первинному класичному варіанті. Цей тип скринінгу називають фенотипічним.

Завдання – отримати спочатку зміну у фенотипі, а потім уже розібратися, як, власне, відбулася потрібна зміна.

Отже, є два основні типи віртуального скринінгу:

Ligand-based Virtual Screening, який базується на просторовій подібності ряду відомих молекул (лігандів), що зв’язуються з молекулярною мішенню;

Structure-based Virtual Screening, який ґрунтується на тривимірній структурі молекулярної мішені.

Перед тим, як перейти до розгляду віртуального скринінгу на основі структури ліганду, згадаємо, що таке фармакофор. Це віртуальна структура, це певна сума фармакофорних центрів, що визначають взаємодію різних лігандів з мішенню. Власне, фармакофор і пояснює, чому хімічно різні ліганди взаємодіють однаково з мішенню.

Розглянемо віртуальний скринінг на основі структури ліганду. Як правило, цей підхід застосовується для молекулярних мішеней, для яких немає просторової структури.

На першому етапі проводять так звану кластеризацію активних лігандів. Потім будується фармакофорна модель. Модель верифікується і нарешті використовується для пошуку інгібіторів серед бібліотек низькомолекулярних органічних речовин.

QSAR посідає особливе місце в цій схемі. Ми не застосовуємо QSAR. Один із провідних світових фахівців у цій галузі – проф. Віктор Кузьмін. Принагідно зазначимо, що він народився в Полтаві.

На слайді подано фармакофорну модель для пошуку інгібіторів протеїнкінази ASK1, що розроблена у відділі біомедичної хімії ІМБіГ НАНУ.

Дизайн на основі структури мішені – це основна наша робоча методологія. Основний принцип цього підходу базується на такій гіпотезі: якщо дві малі молекули однаково взаємодіють з молекулярною мішенню,то вони, очевидно, будуть мати подібний біологічний ефект.

З допомогою докінгу будується залежність міцності комплексів лігандів від їх хімічної структури. Чим міцніший комплекс, тим більша ймовірність біологічної активності лігандів.

Побіжно розглянемо процес розробки ліків на основі структури мішені.

На початку йдуть етапи комп’ютерного моделювання.

Ідентифікація та валідація молекулярної мішені. Складне завдання. Потрібно знайти не лише білок, що є ключовим в перебігу хвороби. Використовуючи генно-інженерні методи, слід довести, що, блокуючи потрібну мішень, можна заблокувати перебіг потрібної хвороби.

Де взяти структури мішеней? Функціонує так званий Protein Data Bank, де структури у вільному доступі. Якщо структури немає, то використовується так зване гомологічне моделювання для розробки структури.

Вибір сайту для докінгу на поверхні білка. Є багато різних алгоритмів. Геометричний – кулі катаються по поверхні білка для пошуку заглибин, розрахунок енергії зв’язування та з допомогою молекулярної динаміки.

Власне докінг. Ми використовуємо так званий напівгнучкий докінг, де структура білка жорстка, а для докінгу використовуються конформери малих органічних сполук. Комерційні програми Flex, Gold застосовуються для гнучкого докінгу. В цьому випадку використовуються і конформери, і рухається білок.

Для швидкого докінгу можна використовувати і нерухому молекулу мішені та відмовитись від конформерів.

Молекулярна динаміка базується на законах Ньютона і використовується для обчислення енергії зв’язування лігандів із сайтом. Вона важлива при хімічній оптимізації. Ви підготували декілька віртуальних структур, які, на ваш погляд, будуть краще зв’язуватися з мішенню. Молекулярна динаміка дає можливість порахувати енергію зв’язування кожної і вибрати найкращу з найнижчою енергією зв’язування.

De novo дизайн – інгібітор збирається з фрагментів у сайті зв’язування.

Фармакофорне моделювання. Про нього говоритимемо пізніше.

Ви провели віртуальний скринінг, відібрали та протестували сполуки. Далі починається робота хіміків-синтетиків, в медичній хімії вона представлена такими термінами:

Hit – сполука, що виявила активність у первинному біологічному тесті після докінгу.

Hit2Lead optimization – хімічна оптимізація хіта, щоб він став лідом.

Lead – сполука, що має первинні властивості ліків – хорошу активність та ADME & Tox властивості, тестування проводиться in vitro, у пробірці.

Lead optimization – хімічна оптимізація lead compound, щоб отримати Drug candidate.

Drug candidate – це сполука, яка використовується для попередніх клінічних і клінічних досліджень, тестування проводиться in vivo, на тваринах та людях.

На слайди подано кінази, які ми використовуємо як молекулярні мішені. Це – СК2, FGFR1 та ASK1. Раніше ми купували ці ферменти, а нині отримуємо самостійно за допомогою рекомбінантних технологій. Щоб кіназа почала працювати, вона повинна бути активована. Після активації кіназа змінює структуру і починає працювати.

Інгібітори цих кіназ – це перспективні протиракові препарати, ліки проти хвороби Альцгеймера.

Варіанти інгібування кінази.

Можна створити рекомбінантний білок, який буде зв’язуватися з неактивною формою по алостенічних сайтах і блокувати перехід в активну форму.

Або синтезувати пептидоміметик та блокувати роботу фосфорилюючого сайту, який фосфорилює власне білок.

Для фосфорилювання ферменту потрібен АТФ – аденозинтрифосфат. Сайт зв’язування АТФ і використовується в медичній хімії для розробки АТФ-конкурентних інгібіторів протеїнкіназ як протиракових ліків.

Є багато проблем зі специфічністю, резистентністю… Але це предмет іншої доповіді.

Як організовано процес пошуку й оптимізації інгібіторів у нашому відділі? Готується віртуальна база. Застосовуються фільтри, ADME/Tox, drug like та lead like, відкидаються сполуки з хімічно активними групами. Потім переходимо до гнучкого докінгу, синтезу й біохімічного тестування. Ми отримуємо декілька сполук-хітів.

Цю схему реалізовано на прикладі розробки інгібіторів протеїнкінази CK2 на основі похідних 4’-гідроксифлавонів. У таблиці наведено дані біохімічного тестування інгібувальної активності синтезованих сполук. Є непогані інгібітори на рівні 1 мкмоля.

Наступний етап: будується модель комплексу найбільш активних інгібіторів з АТФ- зв’язувальним сайтом ферменту. На основі цієї моделі виробляються рекомендації для хімічної оптимізації знайдених інгібіторів. Чим більше специфічних зв’язків ліганд утворить з мішенню, тим міцніший комплекс і тим вища біологічна активність.

У результаті проведеної оптимізації ми отримали інгібітор з наномолярною активністю.

На слайді подано селективність на панелі з 8 кіназ.

Нарешті досить цікаві дані. Зліва комплекс нашого інгібітора, побудований з допомогою молекулярного докінгу. Праворуч – той же комплекс, побудований на основі даних рентгеноструктурного аналізу кристалу інгібітора з білком. Видно, що вони збігаються.

Поділ на ligand based і structure based drug design досить умовний. Ці підходи переплітаються. Іноді будують фармакофор на основі відомої структури мішені. Потім цей фармакофор використовується для віртуального скринінгу. На наступному етапі проводиться так звана оптимізація моделі, оскільки при автоматичній генерації моделі бувають певні неточності.

На наступному слайді подано схему фармакофорного скринінгу за допомогою програми «Pharmer». Ступінь подібності лігандів до моделі визначається так званим індексом RMSD – середньоквадратичним відхиленням в астремах від фармакофорної моделі. Чим менше значення цього індексу, тим краще ліганд відповідає фармакофорній моделі.

В результаті проведеного фармакофорного скринінгу та біохімічного тестування було знайдено декілька нових класів інгібіторів СК2. На малюнку подано один найбільш активний клас.

На слайді подано структури інгібіторів, розроблених у нашому відділі за останню декаду. Зверніть увагу, що є і наномолярні інгібітори. Хоча для старту Hit2Lead оптимізації потрібні одномікромолекулярні інгібітори.

На слайді співробітники нашого відділу, молекулярні біологи, біоінформатики, хіміки, які працюють та працювали в нашому відділі. Власне методології, інгібітори, про які я розповідав, це результат їхньої колективної праці.