Мишень-направленный поиск новых лекарств

О современном состоянии разработки новых лекарств в Украине и мире и рациональном дизайне лекарств – инновационной технологии разработки новых лекарств. 

Доклад д.х.н., проф., заведующего отделом биомедицинской химии ИМБиГ НАН Украины Сергея Ярмолюка на ХXІV Украинской конференции по органической химии

Считаем, что с терминологией медицинской химии есть определенные проблемы. Основательного украинского учебника с продуманными терминами не существует. Подавляющее большинство учебников по медицинской химии, выданных на русском, используют обычную кальку терминов с английского языка.

Например, термин «lead compound» у неспециалиста ассоциируется с соединением, как лидер проходит неизменно и успешно через весь этап lead-оптимизации. Хотя в 98 % этот лидер ведет к поражению, и на финише это совсем другое соединение, имеющее другую химическую структуру.

Учитывая это в докладе будут уживаться англоязычные термины с, возможно не всегда, удачным украинским переводом.

Попутно отметим, что концептуально лучшим учебником по медицинской химии в СНГ является учебник «Медицинская химия» В. Орлова и В. Липсон.

Современные технологии разработки первоклассных лекарств требуют огромных финансовых затрат – около миллиарда евро. Поэтому маркетологические исследования должны лежать в основе любых научных исследований по разработке лекарств.

Первый этап разработки лекарств – выявление так называемых неудовлетворенных потребностей.

Фармацевтические компании разрабатывают только те лекарства, которые могут дать им потенциальную прибыль.

Проведем небольшое маркетологическое исследования перспектив мирового фармацевтического рынка и возможных источников финансирования научных исследований в Украине.

Западные фармацевтические компании для планирования своей деятельности используют так называемые консенсус-прогнозы аналитических маркетологических фирм. Консенсус-прогноз – это обобщающий прогноз многих специалистов-экспертов.

Вот лишь некоторые важные тенденции фармацевтического рынка в примере прогноза EvaluatePharma:

Увеличение продолжительности жизни. Это означает, что страны т.н. золотого миллиарда (США, Канада, Австралия, страны ЕС), очевидно, будут финансировать разработку лекарств для лечения болезней пожилых людей. Речь идет в частности, о нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера. Готовя предложения в УНТЦ, желательно учитывать эту тенденцию.

Лекарства для лечения онкологических, сердечно-сосудистых и инфекционных заболеваний – всегда в тренде.

Персофикованая медицина. Лечение пациента на основе его генетического паспорта. Считается, что именно генетические особенности каждого человека приводят к тому, что на многих людей лекарства не действуют. У человека может быть ген, обуславливающий быстрый метаболизм лекарств. Концентрация падает, и лекарства не работают. Над первым геном человека работали 13 лет. Сейчас в США могут сделать геном за 5000 долларов, а в Китае это будет стоить гораздо дешевле – около 500 долларов.

Достаточно негативная тенденция – уменьшение финансирования разработки новых органических малых молекул. Поскольку миллиард, затрачиваемое на разработку новых лекарств, распределяется между многими другими фирмами, которые сотрудничают с фармацевтическими гигантами, то это плохие перспективы для спонсоров этой конференции, которые работают преимущественно в формате аутсорсинга.

Наиболее негативная тенденция для медицинских химиков – это постепенное вытеснение малых органических молекул в качестве лекарственных средств биотехнологическим препаратами.

В 2015 году биологические лекарства составляли 24% от общих продаж, в 2022 году прогнозируют 29%.

Сейчас на рынке много различных биологических препаратов, которые, в отличие от традиционных химических лекарств, имеют сложный химический состав. Если патентная защита закончился, то вероятность получить полностью идентичный биологический препарат равна нулю.

Согласно FDA ввел такое понятие, как biosimilars – приближенный аналог дженерика. Процедура регистрации препарата biosimilar гораздо дороже, чем обычных дженериков. Как следствие, фирма-производитель оригинального biologic имеет конкурентные преимущества над теми, кто пытается скопировать их препарат.

А в конечном итоге уменьшается финансирование химии малых молекул и увеличивается финансирование биологических лекарств. О чем свидетельствует прогнозируемый объем продаж ТОП 100 лекарств на 2022.

Можно ли надеяться на государственное финансирование? Вопрос риторический. Считаем, что основная проблема заключается даже не в недостатке средств, а собственно, в рудиментарном постсоциалистическом мышлении наших государственных чиновников, которые «разрабатывают» и финансируют программы по разработке лекарств … Какие разработки, когда все фармацевтические компании частные?

Государство должно поддерживать надлежащий уровень национальной науки. Финансировать исследования, создавать базы данных, которые могли бы использовать для разработки новых лекарств частные фирмы и академические учреждения, как, например, это происходит в США.

Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, который я представляю, сотрудничает с Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний США. Сотрудничество заключается в поиске новых соединений для лечения туберкулеза. В соответствии с соглашением между этими институтами мы имеем три месяца на патентование результатов. Затем данные публикуются для всеобщего доступа. Достаточно простой договор о сотрудничестве. Права принадлежат вам. Рекомендуем сотрудничать с этой американской организацией.

Подавать проекты по медицинской химии к европейской программе «Горизонт 2020», считаем, не стоит. В программе достаточно общее направление «Health», в котором говорится о том, что здоровье – это богатство. Финансирование в основном идет на улучшение системы здравоохранения в Европе.

Как показывает опыт, финансовую выгоду от «Горизонт 2020» имеют лишь разные чиновники от науки, организуют различные тренинги за европейские деньги … Подавляющее большинство украинских рядовых ученых не вписывается в формат этой программы.

Украинским ученым нужны небольшие поддерживающие гранты, вроде INTAS. Просим наших почтенных академиков обратить на это внимание.

Еще несколько слов о так называемой программе «Горизонт 2020» для малых и средних предприятий (Small and Middle Enterprises – SME). Финансирования – 50 тыс. Евро. Права принадлежат ученым. Отчеты упрощены.

По треугольнику Дмитрия Сосунова с литовской фирмы «CIVITTA» оценивается вероятность получения финансирования от ЕС. Инновационность – отсутствие аналогов на рынке, потенциальный спрос на рынке и, собственно, профессионализм команды. К тому же ученые должны иметь еще и исследуемый образец …

Одним словом, получить финансирование на разработку новых лекарств или органический синтез практически невозможно.

Один из возможных финансовых источников – это выполнение так называемых контрактных научных исследований. Это объективно. Аутсорсинг для западных фирм всегда будет дешевле.

Однако в последнее время резко возросла конкуренция. Кроме того, западные компании начали работать исключительно через посредников. Основная цель таких посредников VALUE BEYONG SAVING – уменьшить расходы и риски аутсорсинга. Они отбирают самых дисциплинированных поставщиков с самыми низкими ценами.

При нынешней затруднительной финансовой ситуации академический аутсорсинг, на наш взгляд, остается единственным реальным дополнительным источником доходов.

Итак, будем считать, что мы нашли финансирование. Перейдем к дизайну лекарств.

Что такое молекулярная мишень? Это в основном белок, который критически задействован в ходе определенной болезни на молекулярном уровне. Если мы блокируем этот белок, то, соответственно, притормаживаем или полностью останавливаем течение той или иной болезни.

Например, факторы роста фибробластов связываются с соответствующими рецепторами, и запускается механизм ангиогенеза – роста кровяных капилляров. В норме во взрослом организме процессы ангиогенеза происходят только во время регенерации поврежденных тканей. В злокачественных опухолях ангиогенез происходит постоянно и очень интенсивно. Опухолевые клетки лучше снабжаются кровью, питательными веществами, им нужны кровяные капилляры. Если мы определенным образом заблокируем этот белок, удалим его из сигнального пути, то это затормозит ход онкологического заболевания.

Рациональный дизайн лекарств – это инновационная, современная технология разработки новых лекарств. Попутно отметим, что и другие более традиционные методологии разработки лекарств тоже эффективны.

Рациональный подход базируется на знании о биологической (молекулярной) мишени.

Два основных условия. Первое – нужно иметь доказательства того, что, воздействуя на мишень, мы влияем на течение болезни. И второе – мишень должна связываться с молекулами-лекарством.

Как функционирует мишень?

Фактор роста фибробластов связывается с рецептором. Происходит димеризация рецептора с последующей активацией трансмебранной тирозиновой киназы через самофосфорилювання. Следствием такого фосфорилирования является запуск сигнальных каскадов, ведущих к синтезу ДНК и пролиферации (роста) клеток.

Как заблокировать мишень?

Как вариант, можно подобрать низкомолекулярный ингибитор, связывается с АТФ-связующим сайтом киназы и, что блокирует ее аутофосфорилирование.

Другой вариант – получить моноклональное антитело, что свяжется с рецептором и тоже заблокирует процесс передачи сигнала. Моноклональные антитела – это препараты антител, высокоспецифичные к одной антигенной детерминанте.

Варианты использования биологических лекарств. Слева на слайде моноклональное антитело, которое связывается с рецептором и блокирует его димеризацию. Справа – причудливый белок, который имеет рецептор. Но этот рецептор не закреплен на поверхности клетки. Он плавает в межклеточном пространстве и вылавливает, связывает белковые факторы роста. Trap – ловушка.

Моноклональные антитела по происхождению мышиные, и чтобы иммунная система человека не уничтожала эти лекарства, они гуманизуються. Это так называемые странные белки, у них есть белковые компоненты человеческого происхождения.

На слайде показаны биологические молекулы, которые используются как молекулярные мишени. Преимущественно это белки. 45% всех молекулярных мишеней – GPCR рецепторы. Это молекулярные мишени для разработки противораковых лекарств, лекарств против диабета.

В одной из статей, опубликованной в Вестнике Академии наук, приведены определения рационального дизайна лекарств как предсказания взаимодействия рецептора и лиганда на молекулярном уровне. Это неправильное определение. Речь идет о частном случае, более низкого порядка.

Вернемся к слайду с определением рационального дизайна. Это важно, поскольку все компьютерные методы базируются на аксиоме, что такое молекулярная мишень.

Итак, выбрав при помощи молекулярных биологов молекулярную мишень, мы можем начинать поиск лекарств. Мы должны найти малые органические молекулы, которые будут связываться с нашей мишенью и блокировать течение болезни.

Как вариант можно использовать т.н. высокопроизводительный скрининг. Взять все вещества, которые есть у вас на полке, и изучить их ингибирующую  активность на вашей молекулярной мишени. Так в принципе все и работали до 2000 года.

Компьютерные методы произвели революцию в разработке лекарств. Появилось такое понятие, как виртуальный скрининг. Он моделирует взаимодействие малых молекул с мишенью, отбирает те, которые лучше всего связываются. Соединения, которые лучше связываются с молекулярной мишенью, с наибольшей вероятностью могут быть ингибиторами этой молекулярной мишени.

Важность компьютерной революции состоит, на наш взгляд, в том, что медицинский химик может работать в привычном для него формате «структура – функция». Можно построить виртуальную модель комплекса мишени с малой молекулой и оценивать, как химическая природа заместителей влияет на прочность комплекса, а прочность комплекса влияет на лечебные свойства.

Попутно отметим, что в последнее время не хватает молекулярных мишеней и высокопроизводительный скрининг начинает применяться в своем первоначальном классическом варианте. Этот тип скрининга называют фенотипическим.

Задача – получить сначала изменение в фенотипе, а потом уже разобраться, как, собственно, произошло требуется изменение.

Итак, есть два основных типа виртуального скрининга:

– Ligand-based Virtual Screening, основанный на пространственной сходства ряда известных молекул (лигандов), которые связываются с молекулярной мишенью;

– Structure-based Virtual Screening, основанный на трехмерной структуре молекулярной мишени.

Перед тем, как перейти к рассмотрению виртуального скрининга на основе структуры лиганда, вспомним, что такое фармакофор. Это виртуальная структура, это определенная сумма фармакофорных центров, определяющих взаимодействие различных лигандов с мишенью. Собственно, фармакофор и объясняет, почему химически различные лиганды взаимодействуют одинаково с мишенью.

Рассмотрим виртуальный скрининг на основе структуры лиганда. Как правило, этот подход применяется для молекулярных мишеней, для которых нет пространственной структуры.

На первом этапе проводят так называемую кластеризацию активных лигандов. Затем строится фармакофорные модель. Модель верифицируется и наконец используется для поиска ингибиторов среди библиотек низкомолекулярных органических веществ.

QSAR занимает особое место в этой схеме. Мы не применяем QSAR. Один из ведущих мировых специалистов в этой области – проф. Виктор Кузьмин. Попутно отметим, что он родился в Полтаве.

На слайде представлена фармакофорная модель для поиска ингибиторов протеинкиназы ASK1, разработанная в отделе биомедицинской химии ИМБиГ НАНУ.

Дизайн на основе структуры мишени – это основная наша рабочая методология. Основной принцип этого подхода базируется на такой гипотезе: если две малые молекулы одинаково взаимодействуют с молекулярной мишенью, то они, очевидно, будут иметь подобный биологический эффект.

С помощью докинга строится зависимость прочности комплексов лигандов от их химической структуры. Чем прочнее комплекс, тем больше вероятность биологической активности лигандов.

Бегло рассмотрим процесс разработки лекарств на основе структуры мишени.

В начале идут этапы компьютерного моделирования.

Идентификация и валидация молекулярной мишени. Сложная задача. Нужно найти не только белок, являющийся ключевым в течении болезни. Используя генно-инженерные методы, следует доказать, что, блокируя нужную мишень, можно заблокировать ход нужной болезни.

Где взять структуры мишеней? Функционирует так называемый Protein Data Bank, где структуры в свободном доступе. Если структуры нет, то используется так называемое гомологической моделирования для разработки структуры.

Выбор сайта для докинга на поверхности белка. Есть много различных алгоритмов. Геометрический – шары катаются по поверхности белка для поиска углублений, расчет энергии связывания и с помощью молекулярной динамики.

Собственно докинг. Мы используем так называемый полугибкий докинг, где структура белка жесткая, а для докинга используются конформеры малых органических соединений. Коммерческие программы Flex, Gold применяются для гибкого докинга. В этом случае используются и конформеры, и движется белок.

Для быстрого докинга можно использовать и неподвижную молекулу мишени и отказаться от конформеров.

Молекулярная динамика базируется на законах Ньютона и используется для вычисления энергии связывания лигандов с сайтом. Она важна при химической оптимизации. Вы подготовили несколько виртуальных структур, которые, на ваш взгляд, будут лучше связываться с мишенью. Молекулярная динамика дает возможность посчитать энергию связывания каждой и выбрать лучшую из низкой энергией связывания.

De novo дизайн – ингибитор собирается из фрагментов в сайте связывания.

Фармакофорное моделирования. О нем будем говорить  позже.

Вы провели виртуальный скрининг, отобрали и протестировали соединения. Далее начинается работа химиков-синтетиков, в медицинской химии она представлена ​​такими терминами:

Hit – соединение, обнаружила активность в первичном биологическом тесте после докинга.

Hit2Lead optimization – химическая оптимизация хита, чтобы он стал лидом.

Lead – соединение, имеющее первоначальные свойства лекарств – хорошую активность и ADME & Tox свойства, тестирование проводится in vitro, в пробирке.

Lead optimization – химическая оптимизация lead compound, чтобы получить Drug candidate.

Drug candidate – это соединение, которое используется для предыдущих клинических и клинических исследований, тестирования проводится in vivo, на животных и людях.

На слайдах подано киназы, которые мы используем как молекулярные мишени. Это – СК2, FGFR1 и ASK1. Ранее мы покупали эти ферменты, а сейчас получаем самостоятельно с помощью рекомбинантных технологий. Чтобы киназа начала работать, она должна быть активирована. После активации киназа изменяет структуру и начинает работать.

Ингибиторы этих киназ – это перспективные противораковые препараты, лекарства против болезни Альцгеймера.

Варианты ингибирования киназы.

Можно создать рекомбинантный белок, который будет связываться с неактивной формой по алостеничних сайтах и ​​блокировать переход в активную форму.

Или синтезировать пептидомиметики и блокировать работу фосфорилирующего сайта, который фосфорилирует собственно белок.

Для фосфорилирования фермента нужен АТФ – аденозинтрифосфат. Сайт связывания АТФ и используется в медицинской химии для разработки АТФ-конкурентных ингибиторов протеинкиназы как противораковых лекарств.

Есть много проблем со специфичностью, резистентностью … Но это предмет другого доклада.

Как организован процесс поиска и оптимизации ингибиторов в нашем отделе? Готовится виртуальная база. Применяются фильтры, ADME / Tox, drug like и lead like, отбрасываются соединения с химически активными группами. Затем переходим к гибкому докингу, синтезу и биохимического тестирования. Мы получаем несколько соединений хитов.

Эту схему реализовано на примере разработки ингибиторов протеинкиназы CK2 на основе производных 4′-гидроксифлавонив. В таблице приведены данные биохимического тестирования ингибувальних активности синтезированных соединений. Есть неплохие ингибиторы на уровне 1 мкмоль.

Следующий этап: строится модель комплекса наиболее активных ингибиторов с АТФ- связующим сайтом фермента. На основе этой модели вырабатываются рекомендации для химической оптимизации найденных ингибиторов. Чем больше специфических связей лиганд образует с мишенью, тем прочнее комплекс и тем выше биологическая активность.

В результате проведенной оптимизации мы получили ингибитор с наномолярный активностью.

На слайде представлены селективность на панели 8 киназ.

Наконец достаточно интересные данные. Слева комплекс нашего ингибитора, построенный с помощью молекулярного докинга. Справа – тот же комплекс, построенный на основе данных рентгеноструктурного анализа кристалла ингибитора с белком. Видно, что они совпадают.

Разделение на ligand based и structure based drug design достаточно условно. Эти подходы переплетаются. Иногда строят фармакофор на основе известной структуры мишени. Затем этот фармакофор используется для виртуального скрининга. На следующем этапе проводится так называемая оптимизация модели, так как при автоматической генерации модели бывают определенные неточности.

На следующем слайде представлена ​​схема фармакофорного скрининга с помощью программы «Pharmer». Степень сходства лигандов модели определяется так называемым индексом RMSD – среднеквадратичным отклонением в астремах от фармакофорной модели. Чем меньше значение этого индекса, тем лучше лиганд соответствует фармакофорные модели.

В результате проведенного фармакофорного скрининга и биохимического тестирования было найдено несколько новых классов ингибиторов СК2. На рисунке представлены один наиболее активный класс.

На слайде представлены структуры ингибиторов, разработанных в нашем отделе за последнюю декаду. Обратите внимание, что есть и наномолярный ингибиторы. Хотя для старта Hit2Lead оптимизации нужны одномикромолекулярные ингибиторы.

На слайде сотрудники нашего отдела, молекулярные биологи, биоинформатики, химики, которые работали и работают в нашем отделе. Собственно методологии, ингибиторы, о которых я рассказывал, это результат их коллективного труда.