Биотестирование – границы возможного

biotest«Век биологии» – именно таким был провозглашен XXI век еще до своего наступления, пока не стал повседневной реальностью для обычного человека, который продолжает пользоваться плодами «века физики» и, конечно же, «века химии».

Окруженные сотнями тысяч созданных цивилизацией химических веществ, мы начинаем все больше понимать, что вся эта химико-индустриальная мощь может быть опасна для нас самих и той среды, в которой мы существуем. Воздух, которым мы дышим, вода, которую пьем, грунт, дающий нам продукты питания, лекарства, которыми лечимся, строительные материалы для наших домов и многое другое – не представляют ли они угрозы для нашего здоровья и здоровья наших детей, не приведет ли их накопления к необратимым изменениям в живой природе?

 Как получить ответы на эти вопросы, ответы довольно быстрые и такие, что, безусловно, вызывают доверие? В течение последних 10 лет появились крупные международные программы (европейские и американские), цель которых – проверить безопасность десятков тысяч химических соединений, объем производства которых в мире превышает одну тонну. Для реализации этих проектов выделяются большие средства, привлечены сотни высококвалифицированных специалистов, используется современное оборудование.

Все, кажется, понятно: исследования ведутся, им уделяется должное внимание. И здесь на передний план выступает один из важнейших для современной токсикологии вопрос: как реально, в сжатые сроки выполнить такой огромный массив работ по тестированию токсичности невероятного количества новых химических веществ, которые, к тому же, появляются каждый год?

Осведомленный читатель сразу возразит: а как же предназначены для этого белые крысы, кролики и мыши (добавим сюда также кур и собак), которых специально разводят в вивариях и о которых мы слышали еще на уроках биологии в школе? Ведь эти лабораторные животные используются не одно десятилетие, на них получены важные результаты для биологии и медицины. И, кстати, все тот же читатель спросит: разве все вышеупомянутые вещества (особенно лекарственные препараты) не должны проходить экспертизу прежде чем будет разрешено их производство? Тогда в чем же проблема?

Проблем, как минимум, две. Первая: методы проверки токсичности, которые существуют сегодня, очень дорого стоят (речь идет о миллионах долларов на содержание вивариев и проведение тестов) и требуют достаточно много времени для получения достоверных результатов. Так, в соответствии с законодательством различных стран для проверки хронической токсичности (когда эффект проявляется при длительном воздействии небольших доз ядовитого вещества) требуется проведение непрерывного эксперимента продолжительностью от нескольких месяцев до двух лет.

Вторая проблема, более серьезная: насколько надежны данные, полученные на лабораторных животных, при переносе (экстраполяции) их на организм человека. То есть насколько эти показатели токсичности совпадут (будут коррелировать) с результатами, полученными из наблюдений за пациентами в клиниках (в частности, при разработке лекарственных препаратов говорят о доклинических и клинических фазах испытаний). Или иначе, какова их ценность при прогнозе угрозы здоровью человека. И, наконец, этическая проблема: проведение широкомасштабных токсикологических экспериментов связано с гибелью сотен тысяч (даже миллионов) животных, таких же млекопитающих, как и человек.

Помочь в решении поставленных вопросов призваны альтернативные методы биотестирования, созданию и совершенствованию которых уделяется значительное внимание в течение последних 20 лет. Под биотестированием понимается использование систем, в которых применяются различные живые тест-объекты (растения и животные), включая микроорганизмы, изолированные клетки человека и даже очищенные из тканей или искусственно созданные молекулы.

В основе применения таких систем лежат две идеи: а) использование простых методик определения соединений на объектах с высокой чувствительностью к действию токсичных веществ, б) изучение действия агентов, которые нас интересуют, на изолированные (как правило, культивируемые – то есть поддерживаемые некоторое время в созданных искусственных условиях) клетки человека и животных с целью выявления прямого, неопосредованные эффекта токсиканта на ткани-мишени.

Обычно, среди преимуществ биотестирования указывают малое время, необходимое для проведения анализа образца (от нескольких часов до нескольких суток), и сравнительную доступность таких методов, включая сюда достаточно простое оборудование для содержания в лаборатории мелких беспозвоночных и позвоночных животных, таких как ракообразные дафнии или рыбки данио рерио, а также культур клеток млекопитающих и микроорганизмов.

Показательным примером проведения биотестирования может служить использование клеток человека, выращенных в специальных 96-луночных планшетах. После того, как клетки прикрепятся ко дну лунок и адаптируются к условиям микроокружения, в разные лунки добавляют образцы жидкой среды, содержащие возрастающие количества вещества, которое нас интересует.

Через 1-3 суток определяют с помощью специальных красителей жизнеспособность клеток во всех лунках. Там, где наблюдается выраженное действие добавленного агента на клетки, можно предполагать наличие токсического эффекта этой концентрации вещества на соответствующие ткани организма (используются клетки, изолированные из кишечника, кожи, печени, почек и других органов).

Другим интересным объектом является икринки рыбы. Они быстро развиваются, формируя личинки. Можно регистрировать последовательные стадии этого процесса. Если добавить токсичное вещество в водную среду, то наблюдаются различные нарушения и отклонения в развитии эмбрионов, вплоть до их гибели. Чувствительность некоторых водных беспозвоночных животных может быть очень высокой, такой, что превосходит в десятки раз чувствительность изолированных клеток. Этим определялось первоначальное использование таких тестов для обнаружения токсичных веществ в окружающей среде, что входило (и входит) в комплекс мероприятий по экологическому мониторингу.

Несмотря на очевидную перспективность и возможные преимущества альтернативных способов биотестирования, в мире ни один из них сейчас не принят на вооружение, как официально разрешенный метод проверки токсичности лекарственных препаратов или химических веществ бытового назначения. Одним из немногих исключений является применение искусственно выращенных аналогов кожи человека, что позволяет заменить широко используемый в течение многих десятилетий тест на раздражение кожи, в ходе которого исследуемый препарат наносится на глаз кролика (тест Драйза, что очень болезненно для животного).

Применение аналогов кожи проходит завершающие стадии апробации в Европейском Союзе. Интересно отметить, что в разработке доступной коммерческой модели на основе трехмерных культур клеток кожи активно участвовала одна из крупнейших косметологических фирм мира, ведь новые директивы Евросоюза резко ограничивают опыты на животных при создании косметологических препаратов. Можно также вспомнить и перспективные разработки в области определения генотоксичности, основанные на молекулярно-биологических подходах.

В чем же причина сложившейся ситуации с «узакониванием» альтернативных методов в токсикологии? Существует насущная потребность в использовании новых методов, есть многолетние интересные работы многих лабораторий, к тому же методы тестирования на культивируемых клетках активно применяются ведущими фармацевтическими фирмами на этапах разработки и отбора новых препаратов. Что останавливает широкое внедрение этих методов с целью замены (или очень существенного сокращения) опытов на животных-млекопитающих? Возможно, дело просто в рутинной практике использования давно принятых, хотя и несовершенных методов?

К сожалению, на пути дальнейшего развития и официального признания биотестирования в медицине стоит серьезное препятствие. Это проблема правильной интерпретации результатов, полученных на различных биообъектах, а также их корреляции (об этом уже говорилось выше) с данными клинических исследований. Необходимо каким-то образом перекинуть мост между ответом на токсикант, например, ростков лука или плоских червей, и реакцией организма человека! Несмотря на то что, как указывалось, некоторые объекты могут чувствовать присутствие очень малого количества химического соединения, означает ли это, что ткани и органы человека будут реагировать на это же вещество аналогичным образом? Подобный вопрос возникает и при использовании изолированных клеток человека (которые, как ни странно, могут быть менее чувствительны к токсиканту, чем целый организм).

Как пересчитать концентрацию химического соединения, что вызывает эффект в чашке или планшете, на организм человека? Как точно учесть динамику преобразования вещества после его попадания в кровь (основную роль в этом процессе играет, как известно, печень), а также сопоставить общее время действия токсиканта в организме и в модельных условиях? Корреляция между кривыми доза-ответ, полученными с помощью биотестов, и результатами определения токсичности на лабораторных животных оказывается не такой высокой, как это необходимо для надежного использования этих подходов в сертификации новых препаратов.

Идея использовать так называемую «батарею тестов», когда химическое соединение проверяется сразу на группе различных биообъектов, также не снимает главного вопроса: как на основании полученного массива разнородных данных предусмотреть токсикологические характеристики этого вещества для человека. (По основному назначению такие «батареи тестов» используются в лабораториях экологического мониторинга США, Европы, России и Украины). Дальнейшее значительное усложнение систем культивирования клеток вряд ли оправдано, поскольку это приведет к тому, что такие методы будут малодоступными и трудно воспроизводимыми.

С другой стороны, понятно, что предсказания токсичности для человека должно быть связано с использованием определенных коэффициентов пересчета данных, по типу: количество вещества в малом объеме среды в чашке – количество его же в тканевой жидкости в организме. Такой коэффициент существует и в «традиционной» токсикологии: он связан с пересчетом массы тела подопытного животного на вес среднего человека. Другой «фактор неопределенности» учитывает наличие в человеческой популяции некоторого количества особо чувствительных к этому веществу индивидуумов. И здесь возникает вопрос: а возможно ли создать такую ​​систему коэффициентов, что позволит превратить результаты биотестов на полноценное предсказание токсичности для человека?

Считаем, что именно в слове «возможно» лежит ответ на поставленные ранее вопросы. Каждый метод имеет границы своего применения. Использование особо чувствительных биообъектов, изолированных клеток человека или сконструированных методами молекулярной биологии бесклеточных систем анализа – все это имеет свои задачи и реальные ограничения: быстро выявить наличие токсического эффекта, сравнить близкие по своей структуре вещества, определить механизм воздействия на ткани-мишени. Чтобы выйти за эти пределы, необходимо объединить такие модели с другими подходами, поиски которых сейчас ведутся в области теоретической биологии. Вероятно, такой синтез произойдет в ближайшем будущем, но это уже тема другого разговора.

Константин Нижерадзе,
кандидат биологических наук,
научный консультант Научно-сервисной фирмы «ОТАВА»