Стволовые клетки: перспективы применения в лабораторной и медицинской практике

Нобелевская премия в области медицины и физиологии за 2012 год была присуждена за открытие метода преобразования дифференцированных клеток организма обратно в стволовые клетки. Невозможно переоценить значение этого открытия для медицины и фармации. Теперь из тканей пациента с определенной болезнью можно выделить необходимые клетки и превратить их в клетки любых других тканей. Полученные подобным образом ткани можно использовать в терапевтических целях или изучать на них действия новых лекарственных средств.

8 октября Нобелевская ассоциация Каролинского института, Стокгольм, объявила обладателей Нобелевской премии за 2012 год по физиологии и медицине. Ими стали профессор Кембриджского университета Джон Б. Гердон (John B. Gurdon) и профессор Киотского университета Синья Яманака (Shinya Yamanaka), которым удалось опровергнуть тезис в биологии индивидуального развития о необратимости клеточной дифференциации.

В 1962 году Дж. Гердон заменил ядро ​​яйцеклетки лягушки на ядро ​​дифференцированной клетки кишечника. Модифицированная яйцеклетка развилась в нормального головастика. Это доказало факт, что в генетическом материале дифференцированной зрелой клетки сохраняется вся информация, необходимая для развития целого организма. Первоначально открытие Дж. Гердона было скептически воспринято, но через некоторое время его результаты повторили другие ученые. Это положило начало исследованиям, которые в конечном счете привели к клонированию млекопитающих. Однако в эксперименте Дж. Гердона ядро ​​зрелой клетки с помощью микроманипуляций помещалось в цитоплазму зародышевой клетки. Долгое время был открытым вопрос, можно ли интактную дифференцированную клетку возвратить в стволовую.

На этот вопрос смог ответить Синья Яманака. Свое исследование он проводил на культуре in vitro стволовых клеток мышей, изолированных Мартином Эвансом (Martin Evans; Нобелевская премия 2007 года). С. Яманаке удалось найти ряд генов, которые сохраняли клетки в недифференцированном состоянии. Когда некоторые из этих генов были расшифрованы, он попытался использовать их для возврата зрелой клетки в плюрипотентное состояние. С. Яманака с коллегами взяли ряд комбинаций генов, которые вводили в фибробласты соединительной ткани. В результате была найдена комбинация из 4 генов, способная превращать фибробласты в стволовые клетки.

Открытие Дж. Гердона положило начало направлению масштабной области исследований по трансферу ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer – SCNT), которые позволили понять механизмы дифференциации и клеточной специализации. В 1997 году Иеном Вильмутом (Ian Wilmut) и Китом Кемпбелом (Keith Campbell) был получен первый потрясающий результат – рождение овцы Долли в результате SCNT из клетки эпителия молочных желез в яйцеклетку. Стратегия эксперимента И. Вильмута и К. Кэмпбелла основывалась на методике Дж. Гердона с амфибиями с рядом модификаций. С момента рождения Долли в 1997 году с помощью SCNT-методики были получены клоны многих видов млекопитающих, включая мышь, корову, свинью, волка и крупных кошачьих. В 2002 году были получены мыши, клонированные из ядра В- и Т-лимфоцитов. Это стало доказательством того, что даже такие высокоспециализированные клетки, которые в течение жизни претерпевают существенные эпигенетические изменения, несут в себе потенциал для развития полноценного организма.

Дальнейшее развитие исследований в области плюрипотентности связано с работами С. Яманаки. Его лаборатория сосредоточилась на факторах, необходимых для поддержания плюрипотентности в стволовых эмбриональных клетках. В результате С. Яманаке удалось идентифицировать ген плюрипотентности Nanog, а также 24 транскрипционных фактора, присутствующих в стволовых клетках, которые гипотетически имеют отношение к плюрипотентности. Также лабораторией С. Яманаки было установлено, что слияние цитоплазмы стволовых и соматических клеток вызывает возвращение последних в плюрипотентное состояние.

Затем С. Яманакой были расшифрованы генетические последовательности, кодирующие открытые им факторы транскрипции, которые имеют отношение к плюрипотентности, и эксперимент, в котором данные 24 гена с помощью ретровирусных векторов вводили в фибробласты кожи. В некоторых случаях фибробласты образовывали колонии, напоминающие культуру стволовых клеток. Затем С. Яманака с коллегами удаляли ряд генов в различных комбинациях. Таким образом, количество факторов транскрипции, необходимых для возвращения дифференцированных клеток в состояние плюрипотентных стволовых клеток, было сокращено до 4 (Myc, Oct3/4, Sox2 и Klf4). Полученные подобным образом клетки были названы С. Яманакой индуцированными стволовыми плюрипотентными клетками (induced pluripotent stem cells – iPS cells).

В начальных экспериментах iPS-клетки появлялись с очень низкой частотой. Однако, введя в геном мышей, которых использовали для получения iPS-клеток, ген устойчивости к неомицину, удалось получить культуру таких клеток. (Экспрессия этого гена активировалась только в iPS-клетках, но не в дифференцированных, соответственно iPS-клетки приобретали устойчивость к данному антибиотику).

Полученные iPS-клетки вводили в бластоцисты химерных мышей (метод получения лабораторных животных, при котором in vitro выращивают эмбрионы до стадии 8 бластомеров, потом агрегируют клетки эмбрионов от различных доноров и выращивают in vitro эмбрион до стадии бластоцисты, после чего подсаживают в матку). В результате наблюдали развитие многочисленных видов тератом. Тем не менее, в первом исследовании С. Яманаке не удалось получить стабильную культуру iPS-клеток. Эта задача была выполнена в 2007 году, когда группе С. Яманаки, параллельно с группами Рудольфа Джеениша (Rudolf Jaenisch – один из пионеров клонирования) и Конрада Хохедлингера (Konrad Hochedlinger), удалось усовершенствовать систему отбора, и они смогли создать стабильную линию iPS-клеток. В том же году лабораториям С. Яманака и Джеймса Томсона (James Thomson) параллельно удалось впервые получить iPS-клетки человека. При этом С. Яманакой  были использованы гены тех же 4 факторов транскрипции, что и при экспериментах на мышах (Myc, Oct4, Sox2 и Klf4), тогда как Дж. Томсон использовал несколько иную комбинацию транскрипционных факторов (Lin28, Nanog, Oct4 и Sox2).

Сделанное  Дж. Гердоном и С. Яманакой открытие дало новый импульс исследованиям в области трансдифференцировання – непосредственному превращению одного типа клеток в другой, минуя стадию iPS-клеток. Эти исследования были начаты еще в 1960-е годы в экспериментах с имагинальным диском дрозофилы (зачаток будущего органа в личинках и куколках насекомых, имеет форму диска и состоит из нескольких слоев довольно однородных эпителиальных клеток, расположенных вокруг узкого просвета). В то время удалось превратить фибробласты в миобласты с помощью активации единственного гена (который назвали  MyoD).

Однако только после исследований С. Яманаки, модифицируя его методику поиска транскрипционных факторов, ответственных за дифференциацию, удалось получить стабильные результаты. Так, была показана возможность преобразования экзокринных клеток поджелудочной железы в эндокринные, а фибробластов – в кардиомиоциты. Также была продемонстрирована возможность изменения дифференциации тканей, развивающихся даже из разных зародышевых листков: так, из фибробластов (мезодерма) были получены нейробласты (эктодерма). В том году появились первые данные об успешном изменении трансдифференциации клеток млекопитающих in vivo.

С применением стволовых клеток, как и с возможностями трансдифференцирования, связаны определенные надежды фармацевтов и врачей. iPS-клетки гипотетически могут быть использованы для замены больных клеток при ряде дегенеративных болезней, например болезни Паркинсона или сахарном диабете I типа. Также существует возможность с помощью iPS-клеток преодолеть проблему иммунного отторжения органов при трансплантации. Впрочем, практическое использование iPS-клеток – дело прошлого. Чтобы подобные методики нашли применение в клинической практике, нужно значительно улучшить и удешевить методики выращивания iPS-клеток.

Также вызывают вопросы проблемы безопасности. Применяемые в настоящее время для получения iPS-клеток процедуры потенциально могут вызвать мутации и другие генетические нарушения, ограничивающие использование iPS-клеток для терапии. Одним словом, хотя применение iPS-клеток в медицине открывает фантастические горизонты, нужны дальнейшие исследования для доказательства безопасности этого метода терапии.

Другая, более реалистичная перспектива – исследование ряда генетических болезней и болезней с генетической предрасположенностью. Получив от пациентов культуру iPS-клеток, можно лучше понять процессы, которые вызывают болезнь, а также проводить на этих культурах токсикологические исследования новых лекарственных средств. В настоящее время уже получены культуры iPS-клеток от пациентов с амиотрофным латеральным склерозом, синдромом Ретта, спинальной мышечной атрофии, недостаточностью антитрипсина α1, семейной гиперхолестеринемией и болезнью Гирке (гликогеноз I типа с дефектом глюкозо-6-фосфатазы).

Уже сейчас культуры iPS-клеток используются в исследованиях в области кардиологии для изучения синдрома удлиненного интервала Q-T I и II типов.

Также на iPS-клеточных моделях болезней были обнаружены связи между фенотипом клеточной культуры и болезнью. Например, у нейробластов, выращенных из iPS-клеток, полученных от больных амиотрофным латеральным склерозом, отмечается прогрессивное уменьшение подвижности, а у нейробластов из iPS-клеток, полученных от больных синдромом Ретта, было выявлено уменьшение размеров дендритных отростков. Гепатоциты,  полученные из  iPS-клеток людей, страдающих болезнью Гирке, показали избыточное накопление гликогена и жиров.

Выявленная закономерность позволяет предположить, что культуры iPS-клеток могут быть успешно использованы для моделирования болезней с поздним развитием, таких как болезнь Альцгеймера, спиноцеребральная атаксия и болезнь Хантингтона.

Также определенный прогресс был достигнут при изучении болезней со сложной генетикой, например, шизофрении.

При исследовании iPS-клеточной модели семейной дизавтономии было найдено новое активное вещество, названное кинетин, которое частично уменьшает нарушение сплайсинга гена IKBKAP (что вызывает болезнь). Также на iPS-клеточной модели была доказана нормализация фенотипа клеток при назначении блокаторов бета-адренорецепторов и блокаторов ионных каналов при синдроме увеличение интервала Q-T.

Таким образом, сделанное Дж. Гердоном и С. Яманакой открытие уже закрепилось, если не в клинической, то в лабораторной практике. Культуры iPS-клеток успешно используются в качестве скрининговых платформ для разработки и тестирования новых лекарственных средств.

Однако, это только начало большого пути. Пути, который показывает для науки открытие, доказавшее возможность возвращения зрелых клеток в их эмбриональное детство.

Ресурс: http://www.apteka.ua/article/165444