Существует ли в Украине рациональный дизайн – новейшая технология разработки лекарств?

Направленное конструирование лекарственных средств иногда еще называют драг-дизайном (англ. Drug – лекарственный препарат, design – конструирование). Эта современная технология поиска новых лекарств базируется на новейших достижениях молекулярной биологии, биоинформатики, компьютерного моделирования и медицинской химии. Практически все ведущие мировые фармацевтические компании используют для разработки новых лекарств подход, который называется «рациональным дизайном» и базируется на предположении взаимодействий рецептора и лиганды на молекулярном уровне. Эта технология позволяет не только более направленно «искать иголку в стоге сена», но и значительно уменьшать финансовые расходы при разработке лекарств.

Сейчас подавляющее большинство украинских фармацевтических предприятий завозят из-за границы субстанции, на основе которых изготавливают «собственные» лекарства, а точнее, делают дженеричные копии эффективных и популярных в мире лекарств. Понятно, что у владельцев этих предприятий нет ни желания, ни значительных средств на разработку инновационных препаратов. Для чего изобретать что-то новое, когда и старое продается неплохо?

А существует ли технология направленного конструирования лекарственных средств в Украине? Да, она используется и постоянно совершенствуется усилиями ученых Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины, который возглавляет акад. А.В. Ельская. В отделе комбинаторной химии этого института выполняются научные исследования по рациональному дизайна ингибиторов протеинкиназ как перспективных противораковых лекарственных средств.

Эта статья является попыткой рассказать о технологии рационального дизайна лекарств, разработанной сотрудниками отдела комбинаторной химии ИМБиГ НАН Украины.

Paryg_1

Заведующий отделом проф. С.М. Ярмолюк во время научной командировки в Muséum National d’Histoire Naturelle, Франция, 2009 г.

На чем базируется рациональный дизайн лекарств?

Рациональный дизайн лекарств основывается, собственно, на взаимодействии двух молекул: биологической мишени и молекулы лекарств. Мишень – это биологическая макромолекула, как правило, белок, на молекулярном уровне выполняющая определенную функцию в организме. Считается, что нарушение нормального функционирования мишени вызывает заболевание организма. Итак, облегчить течение заболевания для больного или вылечить его совсем можно воздействуя молекулами лекарств на мишень. Самые распространенные мишени – это рецепторы и ферменты. Лекарства – это химические соединения (как правило, низкомолекулярные), которые специфически взаимодействуют с мишенью и влияют на ее функцию. Рационально подобранное химическое соединение связывается с молекулярной мишенью как ключ с замком, и, как следствие, течение заболевания замедляется или полностью блокируется.

Если мишенью выступает рецептор, то лекарство будет, скорее всего, его лигандом, то есть соединением, которое специфически взаимодействует с активным сайтом рецептора. Степень взаимодействия лиганда с мишенью измеряют аффинностью, или родством. Аффинность равна концентрации лиганда, при которой половина мишеней связывается с лигандом. Мерилом биологической активности лиганда является та концентрация лиганда, при которой клеточный ответ равен половине максимального.

Как выбирают молекулярную мишень для рационального дизайна?

Один из самых важных начальных этапов рационального дизайна белков – это правильный выбор молекулярной мишени. Воздействуя на мишень соответствующими лигандами (лекарствами), можно специфически регулировать лишь один биохимический процесс, не действуя на другие процессы в организме. Этот процесс правильного выбора мишени называется валидацией мишени. Следует быть уверенными, что именно наша мишень является ключевой в развитии заболевания и, блокируя эту мишень лигандами (лекарствами), мы останавливаем развитие болезни в организме.

Ученые отдела комбинаторной химии исследуют протеинкиназы как молекулярные мишени. Ингибиторы протеинкиназ являются наиболее перспективными молекулярными мишенями для дизайна новых препаратов, используемых в терапии многих патологических процессов. В мире девять ингибиторов протеинкиназ как противораковые препараты (Gleevec, Iressa Tarceva и др.) прошли все фазы клинических тестов и внедрены для клинического использования, еще более 500 ингибиторов киназ находятся на разных стадиях клинических испытаний.

Комбинаторный синтез библиотек органических веществ

Когда ключевая роль мишени в развитии заболевания экспериментально подтверждена, начинаются исследования, направленные на поиск лигандов – низкомолекулярных органических соединений, которые, связываясь с мишенью, блокировали бы ее биологическую активность.

Самый простой подход – «слепое» тестирование биологической активности у максимального количества органических соединений. Такой подход преимущественно и использовался на первых этапах развития методологии рационального дизайна.

Комбинаторная химия – это сумма методов, с помощью которых большое количество структурно разных органических молекул могут быть синтезированы одновременно для нужд биологического анализа. Изюминкой комбинаторной химии является то, что широкий спектр аналогов синтезируется с использованием одной и той же химической реакции, которая проводится в одной и той же реакционной емкости. Таким образом, химик может синтезировать сотни или тысячи соединений в течение короткого времени, используя специально разработанные для этих целей методики.

Традиционно химики делают одно соединение от начала до конца. Например, соединение А реагирует с соединением В, давая соединение АВ. Затем химик последовательно выделяет, очищает и характеризует полученное соединение.

A + B = AB

Методология комбинаторной химии дает возможность в условиях однотипной реакции перебрать все комбинации исходных соединений от A1 до An с соединениями от B1 до Bn.

Разработано много различных методов комбинаторной химии, как в растворе, так и на твердой фазе. Однако, каковы бы ни были эти методы, все они дают возможность синтезировать тысячи органических веществ по сравнению с десятками, получаемыми с помощью традиционных химических методов.

Tolya_1

Сотрудник отдела комбинаторной химии А. Синюгин синтезирует исходные вещества для приготовления комбинаторных библиотек, ИМБиГ НАН Украины, 2011 г.

Синтезированные серии органических соединений используются для высокопроизводительного биологического скрининга. Скринингом (или сканированием) называется конвееризованная процедура, в результате которой большое количество химических соединений (> 10000) проверяется на аффинность или активность по отношению к мишени в специальной тестовой системе, имитирующей биологическую.

По продуктивности различают разные виды скрининга: низкопродуктивный (10000-50000 образцов), среднепродуктивный (50000-100000 образцов), высокопродуктивный (100000-5000000  образцов).

Для скрининга как для «промышленной» процедуры очень критичны эффективность, стоимость и время, затраченное на эту операцию. Как правило, скрининг проводится на роботизированных установках, способных работать в круглосуточном и круглогодичном режиме.

Принцип скрининга достаточно прост: в плашки, содержащие тестовую систему (например, иммобилизованную мишень или специальным образом модифицированные отдельные клетки), робот раскапывает из пипетки исследуемые вещества (или смесь веществ), следуя заданной программе. Затем происходит считывание данных с плашки, которое говорит о том, в какой лунке выявлено биологическую активность, а где – нет. В зависимости от используемой технологии детектор может считывать радиоактивный сигнал, флуоресценцию (если система построена с использованием флуоресцентных зондов), биолюминесценцию (если используется люциферин – люциферазная система или ее аналоги), поляризацию излучения и многие другие параметры.

Olya_1

Сотрудник отдела комбинаторной химии О. Остринская тестирует химические соединения для поиска ингибиторов протеинкиназы, ИМБиГ НАН Украины, 2011 г.

Однако технология высокопроизводительного биологического скрининга имеет ряд недостатков. Во-первых, она требует больших финансовых затрат на дорогостоящее биологическое тестирование и синтез огромных комбинаторных библиотек. Во-вторых, есть большая вероятность, что в гигантских библиотеках не найдётся нужной химической структуры с максимальной аффинностью к определенной мишени. Есть также много и методических оговорок. Вещества часто выпадают в осадок после добавления в водный раствор белка, достаточно сложно определить их концентрации для вычисления биологической активности, окрашенные вещества искажают результаты тестов, основанных на флуоресценции.

Компьютерные методы уменьшения количества соединений для биологического тестирования

Первыми широко известным правилами ограничения количества структур, используемых для биологического тестирования, были правила Липинского. Эти критерии отбора химических соединений были разработаны на основе сравнительного анализа тысяч известных лекарств для орального применения. Позже эти правила были дополнены, начали применяться ко всем лекарствам и получили название «подобия лекарству» (drug-likeness). Итак, соединение, которое может быть лекарственным средством, должна отвечать следующим требованиям:

  1. Иметь менее пяти атомов-доноров водородной связи.
  2. Иметь молекулярный вес не более 500.
  3. Иметь липофильность (logP – коэффициент распределения вещества на границе раздела вода-октанол) меньше 5.
  4. Иметь суммарно не более 10 атомов азота и кислорода (грубая оценка количества акцепторов водородной связи).
  5. Иметь менее трех NO2-групп.

Кроме того используется много и других фильтров (токсичности, мутагенности, канцерогенности, цитотоксичности, ADME), отвергающих соединения, которые потенциально не могут быть лекарствами. С помощью этих фильтров почти 20% смоделированных химиками виртуальных структур отбраковываются как неперспективные для разработки лекарств.

Применение компьютерных технологий в рациональном дизайне

Прежде всего, следует отметить, что современный уровень развития компьютерных методик не позволяет разрабатывать новые лекарственные препараты только с использованием компьютеров. Основные преимущества, которые дают вычислительные методы в этом случае, – это сокращение времени на выпуск нового лекарства на рынок и снижение стоимости разработок.

Основные компьютерные методы, используемые в драг-дизайне:

  • расчет свойств «подобия лекарству»;
  • предвидение пространственной структуры мишеней и их активных центров;
  • виртуальный скрининг;
  • дизайн новых лекарственных препаратов de novo;
  • моделирование связывания лиганд-мишень;
  • моделирование, основанное только на структуре лиганда.

Что такое виртуальный скрининг?

Это компьютерная (in silico) оценка аффинности или биологической активности большого количества химических соединений на основе моделирования их взаимодействия с соответствующей молекулой мишени, или структурного сходства соединениям с экспериментально определенной аффинностью или активностью. Эта процедура похожа на высокопроизводительный биологический скрининг, но, в отличие от него, выполняется в условиях in silico ( «в компьютере»). Соответственно, виртуальный скрининг может основываться на знаниях о структуре молекулы мишени или только на структуре и аффинности (или активности) лигандов.

Моделирование и виртуальный скрининг, основанный на структуре лиганда

Если трехмерная структура белка-мишени не известна, дизайн новых соединений может осуществляться только на основе данных о структуре и активности уже известных лигандов.

Такой подход основывается на общепринятой в химии и биологии парадигме, которая утверждает, что структура молекулы определяет ее свойства. Изучив связь между структурой известных соединений и их свойствами, можно сконструировать новую молекулу, которая будет иметь желаемые свойства. Эти методы используются как для модификации известных структур с целью улучшения их свойств, так и при поиске новых соединений в компьютерных базах молекул.

Один из таких подходов позволяет устанавливать количественную связь между структурой и активностью (QSAR, Quantitative Structure-Activity Relationship), анализируя сходство так называемых молекулярных полей (CoMFA, Comparative Molecular Field Analysis). CoMFA-модель строится на основе анализа набора лигандов с известной активностью и описывает соединение, которое должно хорошо связываться с исследуемой мишенью. Полученный набор «молекулярных полей» указывает, в каком месте у лиганда должен быть объемный заместитель, а в каком меньше, в каком полярный, а в каком – нет, в каком донор водородной связи, а в каком акцептор и т. д.

Подобные модели могут использоваться в задачах виртуального скрининга библиотек соединений, выполняя роль фармакофора. Главным недостатком методов группы QSAR является то, что они хорошо работают только на близких классах соединений, которые применялись для построения модели; при попытке же предусмотреть активность веществ другой химической природы результат может оказаться недостаточно достоверным.

При относительной простоте компьютерного программного обеспечения этот подход имеет существенный недостаток для украинских реалий. Он требует приобретения за рубежом специальных компьютерных баз данных, связывающих химические структуры соединений с их биологическими свойствами. В условиях уникально скромного финансирования Национальной академии наук Украины купить эти базы невозможно.

Моделирование и виртуальный скрининг, основанный на структуре молекулярной мишени

Очевидно, что достоверность моделирования, как и эффективность всего процесса конструирования новых лекарств, можно существенно повысить, если учитывать не только структуру и свойства лигандов, но и информацию о строении белка-мишени. Методы, учитывающие эти данные носят общее название структурно-ориентированного драг-дизайна (SBDD, Structure-Based Drug Design).

Эти методы не требуют покупки дорогих баз зависимости биологической активности от химической структуры. Информация о трехмерной структуре белков есть в свободном доступе на специальных сайтах. Для моделирования взаимодействия лиганда с мишенью есть также бесплатные академические версии программ (DOCК, AutoDock). Единственной проблемой является лишь то, что для потокового виртуального скрининга применяются только коммерческие программы, стоимость которых приближается к сотне тысяч долларов.

Поскольку в Украине достаточно молодых талантливых программистов, которые имеют биологическое образование, то нами было решено начать разработку собственной программы для структурно ориентированного виртуального скрининга. На разработку программы было потрачено больше четырех лет, и сейчас она успешно используется для виртуального скрининга.

Сотрудник отдела А. Яковенко за разработкой программы структурно ориентированного виртуального скрининга, ИМБиГ НАН Украины, 2003 г.

Последние достижения структурной биологии позволяют не только определять экспериментально структуру мишени, но и строить теоретическую модель нужной нам мишени с учетом ее эволюционного родства с белком, чью трехмерную структуру было уже определено.

Особенно часто к моделированию по гомологии прибегают при разработке лекарств, молекулярными мишенями которых являются так называемые GPCR-рецепторы, которые, как мембранные белки, практически не поддаются кристаллизации для определения их пространственной структуры. Эти молекулярные мишени принадлежат к наиболее употребляемых в фармацевтике, так как около 60% существующих лекарств взаимодействуют с этими рецепторами.

Зная пространственную структуру молекулярной мишени и пространственную структуру лиганда, можно на молекулярном уровне объяснить механизм взаимодействия лиганда с белком, рассчитать аффинность (силу связывания) лиганда с мишенью. В самом простом варианте лиганды с предусмотренно наибольшей аффинностью будут в биологических экспериментах лучше блокировать молекулярную мишень.

С этой целью в отделе комбинаторной химии используется разработанная система потокового рецепторно-ориентированного виртуального скрининга с использованием программ молекулярного докинга DOCК и AUTODOCK. Молекулярный докинг (или молекулярная стыковка) – это метод молекулярного моделирования, который позволяет предусматривать наиболее выгодную для образования устойчивого комплекса ориентацию и положение одной молекулы (лиганд) по отношению к другой (мишень).

Исходной информацией для докинга служат трехмерные структуры белка (рецептора) и лиганда, конформационная подвижность и взаиморасположение которых моделируется в процессе докинга. Результатом моделирования является конформация лиганда, которая наилучшим образом взаимодействует с белковым сайтом связывания.

Докинг позволяет сократить затраты средств и времени за счет проведения процедуры, аналогичной высокопроизводительному биологическому скринингу, на компьютерных комплексах. Эта процедура называется виртуальным скринингом. Программа поочередно берет из библиотеки структуру за структурой, вычисляет для каждой энергию связывания. На основе этой информации для биологического скрининга отбирают соединения с самой низкой энергией связывания.

Основным преимуществом докинга является то, что в «реальных» фармакологических испытаниях нужно будет исследовать не библиотеку, содержащую миллионы соединений, а только «виртуальные прототипы», идентифицированные по энергии связывания на компьютере.

С увеличением компьютерных мощностей и появлением более совершенных алгоритмов докинг лучше оценивает энергию связывания белка с лигандом, учитывает подвижность белковых цепей и влияние растворителя. Однако неизвестно, сможет ли виртуальный скрининг в будущем полностью заменить реальный биохимический эксперимент? Пока это невозможно.

Докинг имеет и недостатки, в частности парадокс сходства, который заключается в том, что соединения с весьма сходными химическими структурами могут иметь диаметрально разную биологическую активность, хотя с точки зрения алгоритмов докинга практически не отличаются. Существуют также и другие проблемы. Из-за этого и в маленьких фирмах, и в компаниях-гигантах, оснащенных самым современным компьютерным оборудованием, результаты докинга нужно обрабатывать вручную. Разумеется, уже не сотни тысяч структур, а сотни. Опытными специалистами каждый лиганд просматривается в комплексе с белком. На подготовку таких специалистов уходят годы, они должны иметь базовое биологическое образование, знания по химии, информатике и, главное, опыт в медицинской химии.

Такие специалисты трудятся в отделе комбинаторной химии, об опыте их работы свидетельствует большой перечень разработанных ингибиторов протеинкиназы, а также количество научных публикаций в престижных западных научных журналах.

Grupa_2

Группа компьютерного моделирования обсуждает проблемы разработки ингибиторов протеинкиназы (слева направо – А. Голуб, А. Грищенко, В. Бджола, Г. Волынец), ИМБиГ НАН Украины 2011

Как разрабатываются ингибиторы в отделе комбинаторной химии?

В процессе разработки ингибиторов протеинкиназы гармонично сочетаются методы компьютерного моделирования, комбинаторной химии и биохимического тестирования.

Работа начинается с рецепторно-ориентированного виртуального скрининга имеющейся в отделе библиотеки химических соединений, которая насчитывает около 100 000 веществ. С помощью программ докинга специалисты группы компьютерного моделирования отбирают около 300 соединений, которые передают для дальнейшего биохимического тестирования.

Bdgol_1

Руководитель группы компьютерного моделирования В.Г. Бджола проводит селекцию перспективных соединений для биологического тестирования, ИМБиГ НАН Украины, 2011 г.

Соединения, которые проявили активность in vitro (hit compounds), снова возвращаются в работу группы компьютерного моделирования и становятся предметом тщательных исследований. Определяются перспективные классы соединений, устанавливается зависимость «структура – активность».

Golub_1

Ученые-биологи А. Голуб и Г. Волынец за работой, ИМБиГ НАН Украины, 2011 г.

С помощью методов компьютерного моделирования разрабатываются модели взаимодействия ингибиторов с АТФ-акцепторных сайтом киназ, на основе которых осуществляется химическая оптимизация соединений с целью повышения эффективности найденных хитов. Далее к работе привлекаются химики, которые подбирают нужные методики и по ним синтезируют «разработаны» структуры. Полученные соединения снова передаются для биохимического тестирования. После тестирования происходит переоценка и модификация отношений «химическая структура – биологическая активность» в соответствии с новыми экспериментальными данными, после чего, при необходимости, начинается новый цикл дизайна.

Такая схема рационального дизайна позволяет за два или три цикла разработать эффективные ингибиторы киназ.

Завершение полного цикла разработки лекарств (доклинические и четыре фазы клинических исследований) согласно мировым стандартам, очевидно, не под силу ни одной украинской фармацевтической компании. Сотрудничество с национальной фармацевтической компанией нужно для завершения разработки лидерного соединения, которое может быть запатентовано в США и Европе, а патент продан более мощной западной фармацевтической компании для дальнейших исследований.

Статью подготовил
заведующий отделом комбинаторной химии
Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины,
д.х.н., проф. Сергей Ярмолюк