Чи існує в Україні раціональний дизайн – новітня технологія розробки ліків?

Спрямоване конструювання лікарських засобів іноді ще називають драг-дизайном (англ. drug – лікарський препарат, design – конструювання). Ця сучасна технологія пошуку нових ліків базується на новітніх досягненнях молекулярної біології, біоінформатики, комп’ютерного моделювання і медичної хімії. Практично всі провідні світові фармацевтичні компанії застосовують для розробки нових ліків підхід, який називається «раціональним дизайном» і базується на передбаченні взаємодій рецептора та ліганду на молекулярному рівні.  Ця технологія дає змогу не лише більш спрямовано «шукати голку в копиці сіна», а й значно зменшувати фінансові видатки під час розробки ліків.

Нині переважна більшість українських фармацевтичних підприємств завозять із-за кордону субстанції, на основі яких виготовляють «власні» ліки, а точніше, роблять дженеричні копії ефективних і популярних у світі ліків. Зрозуміло, що у власників цих підприємств немає ні бажання, ні значних коштів на розробку інноваційних препаратів.  Для чого винаходити щось нове, коли і старе продається непогано?

Та чи існує технологія спрямованого конструювання лікарських засобів в Україні? Так, вона використовується і постійно вдосконалюється зусиллями науковців Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, який очолює акад. Г.В. Єльська. У відділі комбінаторної хімії цього інституту виконуються наукові дослідження з раціонального дизайну інгібіторів протеїнкіназ як перспективних протиракових лікарських засобів.

Ця стаття є спробою розповісти про технологію раціонального дизайну ліків, розроблену співробітниками відділу комбінаторної хімії ІМБіГ НАН України.

Paryg_1

Завідувач відділу проф. С.М. Ярмолюк під час наукового відрядження до Muséum National d’Histoire Naturelle, Франція, 2009 р.

На чому базується раціональний дизайн ліків?

Раціональний дизайн ліків ґрунтується, власне, на взаємодії двох молекул: біологічної мішені та молекули ліків. Мішень – це біологічна макромолекула, як правило, білок, що на молекулярному рівні виконує певну функцію в організмі. Вважається, що порушення нормального функціонування мішені спричинює захворювання організму. Отже, полегшити перебіг захворювання для хворого або вилікувати його зовсім можна діючи молекулами ліків на мішень. Найпоширеніші мішені – це рецептори і ферменти. Ліки – це хімічні сполуки (як правило, низькомолекулярні), що специфічно взаємодіють із мішенню і впливають на її функцію. Раціонально дібрана хімічна сполука зв’язується з молекулярною мішенню як ключ із замком, і, як наслідок, перебіг захворювання сповільнюється чи повністю блокується.

Якщо мішенню виступає рецептор, то ліки будуть, швидше за все, його лігандом, тобто сполукою, що специфічно взаємодіє з активним сайтом рецептора. Ступінь взаємодії ліганда з мішенню вимірюють афінністю, або спорідненістю. Афінність дорівнює концентрації ліганду, при якій половина мішеней зв’язується з лігандом. Мірилом біологічної активності ліганду є та концентрація ліганду, за якої клітинна відповідь дорівнює половині максимальної.

Як вибирають молекулярну мішень для раціонального дизайну?

Один із найбільш важливіших початкових етапів раціонального дизайну ліків – це правильний вибір молекулярної мішені. Впливаючи на мішень відповідними лігандами (ліками), можна специфічно регулювати лише один біохімічний процес, не діючи на інші процеси в організмі.  Цей процес правильного вибору мішені називається валідацією мішені. Слід бути впевненими, що саме наша мішень є ключовою в розвитку захворювання і що, блокуючи цю мішень лігандами (ліками), ми зупиняємо розвиток хвороби в організмі.

Науковці відділу комбінаторної хімії досліджують протеїнкінази як молекулярні мішені. Інгібітори протеїнкіназ є найбільш перспективними молекулярними мішенями для дизайну нових препаратів, що використовуються в терапії багатьох патологічних процесів. У світі дев’ять інгібіторів протеїнкіназ як протиракові препарати (Gleevec, Iressa Tarceva та ін.) пройшли всі фази клінічних тестів і впроваджені для клінічного використання, ще понад 500 інгібіторів кіназ знаходяться на різних стадіях клінічних випробувань.

Комбінаторний синтез бібліотек органічних речовин

Коли ключова роль мішені в розвитку захворювання експериментально підтверджена, розпочинаються дослідження, спрямовані на пошук лігандів – низькомолекулярних органічних сполук, які б, зв’язуючись із мішенню, блокували її біологічну активність.

Найпростіший підхід  – «сліпе» тестування біологічної активності в максимальної кількості органічних сполук. Такий підхід переважно і використовувався на перших етапах розвитку методології раціонального дизайну.

Комбінаторна хімія – це сума методів, з допомогою яких велика кількість структурно різних органічних молекул можуть бути синтезовані одночасно для потреб біологічного аналізу. Родзинкою комбінаторної хімії є те, що широкий спектр аналогів синтезується з використанням однієї і тієї ж хімічної реакції, яка проводиться в одній і тій же реакційній посудині. У такий спосіб хімік може синтезувати сотні або тисячі сполук протягом короткого часу, використовуючи спеціально розроблені для цих цілей методики.

Традиційно хіміки роблять одну сполуку від початку до кінця. Наприклад, сполука А реагує зі сполукою В, даючи сполуку АВ. Потім хімік послідовно виділяє, очищає та характеризує одержану сполуку.

 A + B =AB

Методологія комбінаторної хімії дає можливість в умовах однотипної реакції перебрати всі комбінації вихідних сполук від A1 до An зі сполуками від B1 до Bn.

Розроблено багато різноманітних методів комбінаторної хімії, як у розчині, так і на твердій фазі. Проте, які б не були ці методи, усі вони дають можливість синтезувати тисячі органічних речовин порівняно з десятками, що одержуються за допомогою традиційних хімічних методів.

Tolya_1

Співробітник відділу комбінаторної хімії А. Синюгін синтезує вихідні речовини для приготування комбінаторних бібліотек, ІМБіГ НАН України, 2011 р.

Синтезовані серії органічних сполук використовуються для високопродуктивного біологічного скринінгу. Скринінгом (або скануванням) називається конвеєризована процедура, у результаті якої велика кількість хімічних сполук (›10000) перевіряється на афінність або активність по відношенню до мішені в спеціальній тестовій системі, що імітує біологічну.

За продуктивністю розрізняють різні види скринінгу: низькопродуктивний (10000-50000 зразків), середньопродуктивний (50000-100000 зразків), високопродуктивний (100000-5000000 + зразків).

Для скринінгу як для «промислової» процедури дуже критичні ефективність, вартість і час, витрачений на цю операцію. Як правило, скринінг проводиться на роботизованих установках, здатних працювати в цілодобовому та цілорічному режимі.

Принцип скринінгу досить простий: у плашки, що містять тестову систему (наприклад, іммобілізовану мішень або спеціальним чином модифіковані окремі клітини), робот розкапує з піпетки досліджувані речовини (або суміш речовин), ідучи за заданою програмою. Потім відбувається зчитування даних із плашки, яке говорить про те, в якій лунці виявлено біологічну активність, а в якій – ні. Залежно від використовуваної технології детектор може зчитувати радіоактивний сигнал, флуоресценцію (якщо система побудована з використанням флуоресцентних зондів), біолюмінесценцію (якщо використовується люциферин – люциферазна система або її аналоги), поляризацію випромінювання та багато інших параметрів.

Olya_1

Співробітник відділу комбінаторної хімії О. Остринська тестує хімічні сполуки для пошуку інгібіторів протеїнкінази, ІМБіГ НАН України, 2011 р.

Проте технологія високопродуктивного біологічного скринінгу має ряд недоліків. По- перше, вона вимагає великих фінансових затрат на дороге біологічне тестування і синтез величезних комбінаторних бібліотек. По-друге, є велика ймовірність, що в гігантських бібліотеках не знайдеться потрібної хімічної структури з максимальною афінністю до певної мішені. Є також багато і методичних застережень. Речовини часто випадають в осад після додавання у водний розчин білка, досить складно визначити їхні концентрації для обчислення біологічної активності, забарвлені речовини спотворюють результати тестів, що базуються на флуоресценції.

Комп’ютерні методи зменшення кількості сполук для біологічного тестування

Першими широковідомими правилами обмеження кількості структур, що використовуються для біологічного тестування, були правила Ліпінського. Ці критерії відбору хімічних сполук були розроблені на основі порівняльного аналізу тисяч відомих ліків для орального застосування. Пізніше ці правила були доповнені, почали застосовуватися до всіх ліків і дістали назву «подібності до ліків» (drug-likeness). Отже, сполука, яка може бути лікарським засобом, повинна відповідати таким вимогам:

  1. Мати менше п’яти атомів-донорів водневого зв’язку.
  2. Мати молекулярну вагу не більше 500.
  3. Мати ліпофільність (logP – коефіцієнт розподілу речовини на межі розділу вода-октанол) менше 5.
  4. Мати сумарно не більше 10 атомів азоту і кисню (груба оцінка кількості акцепторів водневого зв’язку).
  5. Мати менше трьох NO2-груп.

Окрім того, використовується багато й інших фільтрів (токсичності, мутагенності, канцерогенності, цитотоксичності, ADME), що відкидають сполуки, які потенційно не можуть бути ліками. За допомогою цих фільтрів майже 20 % змодельованих хіміками віртуальних структур відбраковуються як неперспективні для розробки ліків.

Застосування комп’ютерних технологій у раціональному дизайні

Передусім слід зазначити, що сучасний рівень розвитку комп’ютерних методик не дозволяє розробляти нові лікарські препарати лише з використанням комп’ютерів. Основні переваги, які дають обчислювальні методи в цьому випадку, – це скорочення часу на випуск нових ліків на ринок і зниження вартості розробок.

Основні комп’ютерні методи, що використовуються в драг-дизайні:

  • розрахунок властивостей «подібності до ліків»;
  • передбачення просторової структури мішеней та їхніх активних центрів;
  • віртуальний скринінг;
  • дизайн нових лікарських препаратів de novo;
  • моделювання зв’язування ліганд-мішень;
  • моделювання, засноване лише на структурі ліганду.

Що таке віртуальний скринінг?

Це комп’ютерна (in silico) оцінка афінності чи біологічної активності великої кількості хімічних сполук на основі моделювання їх взаємодії з відповідною молекулою мішені, або структурної подібності до сполук з експериментально визначеною афінністю чи активністю. Ця процедура схожа до високопродуктивного біологічного скринінгу, але, на відміну від нього, виконується в умовах in silico («у комп’ютері»). Відповідно, віртуальний скринінг може базуватись на знаннях про структуру молекули мішені або ж лише на структурі та афінності (чи активності) лігандів.

Моделювання та віртуальний скринінг, що базується на структурі ліганду

Якщо тривимірна структура білка-мішені не відома, дизайн нових сполук може здійснюватися лише на основі даних про структуру й активності вже відомих лігандів.

Такий підхід ґрунтується на загальноприйнятій у хімії та біології парадигмі, яка стверджує, що структура молекули визначає її властивості. Вивчивши зв’язок між структурою відомих сполук та їхніми властивостями, можна сконструювати нову молекулу, яка матиме бажані властивості. Ці методи використовуються як для модифікації відомих структур з метою поліпшення їхніх властивостей, так і при пошуку нових сполук у комп’ютерних базах молекул.

Один із таких підходів дозволяє встановлювати кількісний зв’язок між структурою та активністю (QSAR, Quantitative Structure-Activity Relationship), аналізуючи подібність так званих молекулярних полів (CoMFA, Comparative Molecular Field Analysis). CoMFA-модель будується на основі аналізу набору лігандів з відомою активністю і описує сполуку, яка повинна добре зв’язуватися з досліджуваною мішенню. Отриманий набір «молекулярних полів» указує, в якому місці в ліганду повинен бути об’ємний замісник, а в якому менший, в якому полярний, а в якому – ні, в якому донор водневого зв’язку, а в якому акцептор і т. д.

Подібні моделі можуть використовуватися в задачах віртуального скринінгу бібліотек сполук, виконуючи роль фармакофора. Найголовнішим недоліком методів групи QSAR є те, що вони добре працюють лише на близьких класах сполук, що застосовувалися для побудови моделі; при спробі ж передбачити активність речовин іншої хімічної природи результат може виявитися недостатньо достовірним.

При відносній простоті комп’ютерного програмного забезпечення цей підхід має суттєвий недолік для українських реалій. Він вимагає придбання за кордоном спеціальних комп’ютерних баз даних, що пов’язують хімічні структури сполук з їхніми біологічними властивостями. За умов унікально скромного фінансування Національної академії наук України купити ці бази неможливо.

Моделювання та віртуальний скринінг, що базується на структурі молекулярної мішені

Очевидно, що достовірність моделювання, як і ефективність усього процесу конструювання нових ліків, можна істотно підвищити, якщо враховувати не тільки структуру і властивості лігандів, а й інформацію про будову білка-мішені. Методи, що враховують ці дані, носять загальну назву структурно-орієнтованого драг-дизайну (SBDD, Structure-Based Drug Design).

Ці методи не вимагають покупки дорогих баз залежності біологічної активності від хімічної структури. Інформація про трьохвимірну структуру білків є у вільному доступі на спеціальних сайтах. Для моделювання взаємодії ліганда з мішенню є також безкоштовні академічні версії програм (DOCК, AutoDock). Єдиною проблемою є лише те, що для потокового віртуального скринінгу застосовуються лише комерційні програми, вартість яких наближається до сотні тисяч доларів.

Оскільки в Україні не бракує молодих талановитих програмістів, які мають біологічну освіту, то нами було вирішено почати розробку власної програми для структурно орієнтованого віртуального скринінгу. На розробку програми було витрачено понад чотири роки, і нині вона успішно використовується для віртуального скринінгу.

Співробітник відділу О. Яковенко за розробкою програми структурно орієнтованого віртуального скринінгу, ІМБіГ НАН України, 2003 р.

Останні досягнення структурної біології дають змогу не лише визначати експериментально структуру мішені, а й будувати теоретичну модель потрібної нам мішені з огляду на її еволюційну спорідненість з білком, чию тривимірну структуру було вже визначено.

Особливо часто до моделювання за гомологією вдаються при розробці ліків, молекулярними мішенями яких є так звані GPCR-рецептори, які, як мембранні білки, практично не піддаються кристалізації для визначення їхньої просторової структури. Ці молекулярні мішені належать до найбільш уживаних у фармацевтиці, оскільки приблизно 60 % існуючих ліків взаємодіють з цими рецепторами.

Знаючи просторову структуру молекулярної мішені та просторову структуру ліганду, можна на молекулярному рівні пояснити механізм взаємодії ліганду з білком, розрахувати афінність (силу зв’язування) ліганду з мішенню. У найпростішому варіанті ліганди з передбаченою найбільшою афінністю будуть у біологічних експериментах найкраще блокувати молекулярну мішень.

З цією метою у відділі комбінаторної хімії використовується розроблена система потокового рецепторно-орієнтованого віртуального скринінгу із застосуванням програм молекулярного докінгу DOCК і AUTODOCK. Молекулярний докінг (або молекулярне стикування) – це метод молекулярного моделювання, який дає змогу передбачати найбільш вигідну для утворення стійкого комплексу орієнтацію і положення однієї молекули (ліганд) по відношенню до іншої (мішень).

Вихідною інформацією для докінгу слугують тривимірні структури білка (рецептора) і ліганду, конфірмаційна рухливість і взаєморозташування яких моделюється в процесі докінгу. Результатом моделювання є конформація ліганду, яка найкращим чином взаємодіє з білковим сайтом зв’язування.

Докінг дозволяє скоротити витрати коштів і часу за рахунок проведення процедури, аналогічної до високопродуктивного біологічного скринінгу, на комп’ютерних комплексах. Ця процедура називається віртуальним скринінгом. Програма почергово бере з бібліотеки структуру за структурою, обчислює для кожної енергію зв’язування. На основі цієї інформації для біологічного скринінгу відбирають сполуки з найнижчою енергією зв’язування.

Основною перевагою докінгу є те, що в «реальних» фармакологічних випробуваннях потрібно буде досліджувати не бібліотеку, що містить мільйони сполук, а тільки «віртуальні прототипи», ідентифіковані за енергією зв’язування на комп’ютері.

Зі збільшенням комп’ютерних потужностей і появою більш досконалих алгоритмів докінг краще оцінює енергію зв’язування білка з лігандом, ураховує рухливість білкових ланцюгів і вплив розчинника. Однак невідомо, чи зможе віртуальний скринінг у майбутньому повністю замінити реальний біохімічний експеримент? Поки це неможливо.

Докінг має і недоліки, зокрема парадокс схожості, який полягає в тому, що сполуки з дуже подібними хімічними структурами можуть мати діаметрально різну біологічну активність, хоча точки зору алгоритмів докінгу практично не відрізняються. Існують також і інші проблеми. Через те і в маленьких фірмах, і в компаніях-гігантах, оснащених найсучаснішим комп’ютерним обладнанням, результати докінгу потрібно опрацьовувати вручну. Зрозуміло, уже не сотні тисяч структур, а сотні. Досвідченими спеціалістами кожний ліганд проглядається в комплексі з білком. На підготовку таких фахівців ідуть роки, вони повинні мати базисну біологічну освіту, знання з хімії, інформатики і, основне, досвід у медичній хімії.

Такі спеціалісти працюють у відділі комбінаторної хімії, про досвід їхньої роботи свідчить великий перелік розроблених інгібіторів протеїнкіназ, а також кількість наукових публікацій у престижних західних наукових журналах.

Grupa_2

Група комп’ютерного моделювання обговорює проблеми розробки інгібіторів протеїнкінази (зліва направо – А. Голуб, А. Грищенко, В. Бджола, Г. Волинець), ІМБіГ НАН України, 2011

Як розробляються інгібітори у відділі комбінаторної хімії?

У процесі розробки інгібіторів протеїнкіназ гармонійно поєднуються методи комп’ютерного моделювання, комбінаторної хімії та біохімічного тестування.

Робота розпочинається з рецепторно-орієнтованого віртуального скринінгу наявної у відділі бібліотеки хімічних сполук, яка налічує близько 100 000 речовин. З допомогою програм докінгу спеціалісти групи комп’ютерного моделювання відбирають близько 300 сполук, які передають для подальшого біохімічного тестування.

Bdgol_1

Керівник групи комп’ютерного моделювання В.Г. Бджола проводить селекцію перспективних сполук для біологічного тестування, ІМБіГ НАН України, 2011 р.

Сполуки, які проявили активність in vitro (hit compounds), знову повертаються в роботу групи комп’ютерного моделювання і стають предметом ретельних досліджень. Визначаються перспективні класи сполук, встановлюється залежність «структура – активність».

Golub_1

Науковці-біологи А. Голуб та Г. Волинець за роботою, ІМБіГ НАН України, 2011 р.

За допомогою методів комп’ютерного моделювання розробляються моделі взаємодії інгібіторів з АТФ-акцепторним сайтом кіназ, на основі яких здійснюється хімічна оптимізація сполук з метою підвищення ефективності знайдених хітів. Далі до роботи залучаються хіміки, які добирають потрібні методики і за ними синтезують «розроблені» структури. Отримані сполуки знову передаються для біохімічного тестування. Після тестування відбувається переоцінка та модифікація відношень «хімічна структура – біологічна активність» відповідно до нових експериментальних даних, після чого, за потреби, починається новий цикл дизайну.

Така схема раціонального дизайну дає змогу за два чи три цикли розробити ефективні інгібітори кіназ.

Завершення повного циклу розробки ліків (доклінічні та чотири фази клінічних досліджень) згідно зі світовими стандартами, очевидно, не під силу жодній українській фармацевтичній компанії. Співпраця з національною фармацевтичною компанією потрібна для завершення розробки лідерної сполуки, яка може бути запатентована в США та Європі, а патент проданий більш потужній західній фармацевтичній компанії для подальших досліджень.

Статтю підготував
завідувач відділу комбінаторної хімії
Інституту молекулярної біології і генетики НАН України,
д.х.н., проф.  Сергій Ярмолюк