«Століття біології» – саме таким було проголошено XXI століття ще до свого настання, доки не стало повсякденною реальністю для звичайної людини, яка продовжує користуватися плодами «століття фізики» і, звичайно ж, «століття хімії».
Оточені сотнями тисяч створених цивілізацією хімічних речовин, ми починаємо все більше розуміти, що вся ця хіміко-індустріальна міць може бути небезпечна для нас самих і того середовища, в якому ми існуємо. Повітря, яким ми дихаємо, вода, яку п’ємо, ґрунт, що дає нам продукти харчування, ліки, якими лікуємося, будівельні матеріали для наших будинків і багато чого іншого – чи не являють вони загрози для нашого здоров’я і здоров’я наших дітей, чи не призведе їх накопичення до безповоротних змін у живій природі?
Як отримати відповіді на ці запитання, відповіді досить швидкі і такі, що, безумовно, викликають довіру? Упродовж останніх 10 років з’явилися великі міжнародні програми (європейські й американські), мета яких – перевірити безпеку десятків тисяч хімічних сполук, обсяг виробництва яких у світі перевищує одну тонну. Для реалізації цих проектів виділяються великі кошти, залучені сотні висококваліфікованих фахівців, використовується сучасне обладнання.
Усе, здається, зрозуміло: дослідження ведуться, їм приділяється належна увага. І тут на перший план виступає одне з найважливіших для сучасної токсикології питань: як реально, у стислі терміни виконати такий величезний масив робіт із тестування токсичності неймовірної кількості нових хімічних речовин, які, до того ж, з’являються щороку?
Обізнаний читач одразу заперечить: а як же призначені для цього білі щури, кролики й миші (додамо сюди також курей і собак), яких спеціально розводять у віваріях та про яких ми чули ще на уроках біології в школі? Адже ці лабораторні тварини використовуються не одне десятиліття, на них отримані важливі результати для біології і медицини. І, до речі, усе той же читач запитає: хіба всі вищезгадані речовини (особливо лікарські препарати) не повинні проходити експертизу перш ніж буде дозволено їх виробництво? Тоді в чому ж проблема?
Проблем, як мінімум, дві. Перша: методи перевірки токсичності, які існують сьогодні, дуже дорого коштують (ідеться про мільйони доларів на утримання віваріїв і проведення тестів) та вимагають досить багато часу для отримання достовірних результатів. Так, згідно із законодавством різних країн для перевірки хронічної токсичності (коли ефект проявляється за тривалої дії невеликих доз отруйної речовини) потрібне проведення безперервного експерименту тривалістю від декількох місяців до двох років.
Друга проблема, більш серйозніша: наскільки надійні дані, отримані на лабораторних тваринах, при перенесенні (екстраполяції) їх на організм людини. Тобто наскільки ці показники токсичності збігатимуться (будуть корелювати) з результатами, отриманими зі спостережень за пацієнтами в клініках (зокрема, при розробці лікарських препаратів говорять про доклінічну і клінічні фази випробувань). Або інакше, яка їх цінність при передбаченні загрози для здоров’я людини. І, нарешті, етична проблема: проведення широкомасштабних токсикологічних експериментів пов’язане із загибеллю сотень тисяч (навіть мільйонів) тварин, таких же ссавців, як і людина.
Допомогти у вирішенні поставлених питань покликані альтернативні методи біотестування, створенню і вдосконаленню яких приділяється значна увага впродовж останніх 20 років. Під біотестуванням розуміється використання систем, в яких застосовуються різноманітні живі тест-об’єкти (рослини й тварини), включаючи мікроорганізми, ізольовані клітини людини і навіть очищені з тканин або штучно створені молекули.
В основі застосування таких систем лежать дві ідеї: а) використання простих методик визначення сполук на об’єктах з високою чутливістю до дії токсичних речовин, б) вивчення дії агентів, які нас цікавлять, на ізольовані (як правило, культивовані – тобто підтримувані деякий час у створених штучних умовах) клітини людини і тварин з метою виявлення прямого, неопосередкованого ефекту токсиканта на тканини-мішені.
Зазвичай, серед переваг біотестування вказують малий час, необхідний для проведення аналізу зразка (від декількох годин до декількох діб), і порівняльну доступність таких методів, включаючи сюди досить просте устаткування для утримання в лабораторії дрібних безхребетних і хребетних тварин, таких як ракоподібні дафнії або рибки даніо реріо, а також культур клітин ссавців та мікроорганізмів.
Показовим прикладом проведення біотестування може слугувати використання клітин людини, вирощених у спеціальних 96-лункових планшетах. Після того, як клітини прикріпляться до дна лунок і адаптуються до умов мікрооточення, у різні лунки додають зразки рідкого середовища, що містять зростаючі кількості речовини, яка нас цікавить.
Через 1-3 доби визначають за допомогою спеціальних барвників життєздатність клітин в усіх лунках. Там, де спостерігається виражена дія доданого агента на клітини, можна припускати наявність токсичного ефекту цієї концентрації речовини на відповідні тканини організму (використовуються клітини, ізольовані з кишечнику, шкіри, печінки, нирок та інших органів).
Іншим цікавим об’єктом є ікринки риби. Вони швидко розвиваються, формуючи личинки. Можна реєструвати послідовні стадії цього процесу. Якщо додати токсичну речовину у водне середовище, то спостерігаються різні порушення і відхилення в розвитку ембріонів, аж до їхньої загибелі. Чутливість деяких водних безхребетних тварин може бути дуже високою, такою, що перевершує в десятки разів чутливість ізольованих клітин. Цим визначалося первісне використання таких тестів для виявлення токсичних речовин у довкіллі, що входило (і входить) у комплекс заходів з екологічного моніторингу.
Незважаючи на очевидну перспективність і вірогідні переваги альтернативних способів біотестування, у світі жоден з них нині не прийнятий на озброєння як офіційно дозволений метод перевірки токсичності лікарських препаратів або хімічних речовин побутового призначення. Одним із небагатьох винятків є застосування штучно вирощених аналогів шкіри людини, що дає змогу замінити широко використовуваний протягом багатьох десятиліть тест на подразнення шкіри, у ході якого досліджуваний препарат наноситься на око кролика (тест Драйза, що дуже болючий для тварини).
Застосування аналогів шкіри проходить завершальні стадії апробації в Європейському Союзі. Цікаво відмітити, що в розробленні доступної комерційної моделі на основі тривимірних культур клітин шкіри активно брала участь одна з найбільших косметологічних фірм світу, адже нові директиви Євросоюзу різко обмежують досліди на тваринах під час створення косметологічних препаратів. Можна також згадати й перспективні розробки в галузі визначення генотоксичності, що базуються на молекулярно-біологічних підходах.
У чому ж причина ситуації, що склалася з «узаконенням» альтернативних методів в токсикології? Існує насущна потреба у використанні нових методів, є багаторічні цікаві роботи багатьох лабораторій, до того ж методи тестування на культивованих клітинах активно застосовуються провідними фармацевтичними фірмами на етапах розробки й відбору нових препаратів. Що зупиняє широке впровадження цих методів з метою заміни (або дуже істотного скорочення) дослідів на тваринах-ссавцях? Можливо, справа просто в рутинній практиці використання давно прийнятих, хоч і недосконалих методів?
На жаль, на шляху подальшого розвитку й офіційного визнання біотестування в медицині стоїть серйозна перешкода. Це проблема правильної інтерпретації результатів, отриманих на різних біооб’єктах, а також їх кореляції (про це вже йшлося вище) з даними клінічних досліджень. Необхідно якимось чином перекинути міст між відповіддю на токсикант, наприклад, проростків лука або плоских черв’яків, і реакцією організму людини! Незважаючи на те що, як вказувалося, деякі об’єкти можуть відчувати присутність дуже малої кількості хімічної сполуки, чи означає це, що тканини й органи людини реагуватимуть на цю ж речовину аналогічним чином? Подібне запитання виникає і при використанні ізольованих клітин людини (які, як не дивно, можуть бути менш чутливі до токсиканта, ніж цілий організм).
Як перерахувати концентрацію хімічної сполуки, що викликає ефект у чашці або планшеті, на організм людини? Як точно врахувати динаміку перетворення речовини після її потрапляння в кров (основну роль у цьому процесі відіграє, як відомо, печінка), а також зіставити загальний час дії токсиканта в організмі і в модельних умовах? Кореляція між кривими доза-відповідь, отриманими за допомогою біотестів, і результатами визначення токсичності на лабораторних тваринах виявляється не такою високою, як це необхідно для надійного використання цих підходів у сертифікації нових препаратів.
Ідея використати так звану «батарею тестів», коли хімічна сполука перевіряється одразу на групі різноманітних біооб’єктів, також не знімає головного питання: як на підставі отриманого масиву різнорідних даних передбачити токсикологічні характеристики цієї речовини для людини. (За основним призначенням такі «батареї тестів» використовуються в лабораторіях екологічного моніторингу США, Європи, Росії та України). Подальше значне ускладнення систем культивування клітин навряд чи виправдане, оскільки це призведе до того, що такі методи стануть малодоступними і важковідтворюваними.
З іншого боку, зрозуміло, що передбачення токсичності для людини має бути пов’язане з використанням певних коефіцієнтів перерахунку даних, за типом: кількість речовини в малому об’ємі середовища в чашці – кількість його ж у тканинній рідині в організмі. Такий коефіцієнт існує і в «традиційній» токсикології: він пов’язаний з перерахунком маси тіла піддослідної тварини на вагу середньої людини. Інший «чинник невизначеності» враховує наявність у людській популяції деякої кількості особливо чутливих до цієї речовини індивідуумів. І тут виникає запитання: а чи можливо створити таку систему коефіцієнтів, що дасть змогу перетворити результати біотестів на повноцінне передбачення токсичності для людини?
Вважаємо, що саме в слові «можливо» лежить відповідь на поставлені раніше питання. Кожен метод має межі свого застосування. Використання особливо чутливих біооб’єктів, ізольованих клітин людини або сконструйованих методами молекулярної біології безклітинних систем аналізу – усе це має свої завдання й реальні обмеження: швидко виявити наявність токсичного ефекту, порівняти близькі за своєю структурою речовини, визначити механізм дії на тканині-мішені. Щоб вийти за ці межі, необхідно об’єднати такі моделі з іншими підходами, пошуки яких зараз ведуться в галузі теоретичної біології. Ймовірно, такий синтез станеться в близькому майбутньому, але це вже тема іншої розмови.
Костянтин Ніжерадзе,
кандидат біологічних наук,
науковий консультант Науково-сервісної фірми «ОТАВА»